国内激光双光子显微镜成像原理：激光荧光共聚焦显微镜的工作原理

背景

激光荧光共聚焦显微镜（CLSM）是近代最先进的细胞生物分析/仪器之一。是在1957年，Marvin Minsky首先提出这一概念，经过多年的发展才实现显微镜所需要的激光束扫描技术，点对点扫描构建二维图像以及到后期根据多张二维光学图像构建三维图像。激光共聚焦显微镜是在荧光成像的基础上加装激光，激光扫描器，针孔等装置，使用可见光激光荧光探针结合计算机进行图像处理，不仅可以观察固定的细胞，组织切片还可以对活细胞的结构，分子，离子进行实时动态地观察和检测。

工作原理

下图所示为激光荧光共聚焦显微镜的光路图，输出激光通过照明针孔再经由分色镜反射到物镜，最后聚焦到样品表面，激光会与生物组织样本中的荧光物质相互作用产生荧光，部分荧光信号会沿着入射光路相反方向通过物镜后进入二向色镜（Beam Splitter），最终被探测器收集。由于针孔与样品的焦平面处形成共轭关系，所以焦平面以外的反射信号会被针孔滤除，使得共聚焦显微镜具有一定的层析能力。经过针孔后的荧光信号具有较强的层析能力，同时由于光强较弱，需要使用灵敏度较高的光电探测器进行探测。光电倍增管可以将荧光信号放大并转换为电信号（光电探测器输出的电信号强度与荧光强度成正比）然后传输给电脑，电脑通过特定的处理方法将电信号转换成图像信息。

共聚焦显微镜的构成

激光器（Laser）

配置四条激光通道（405nm，488nm，561nm，638nm，波长可选）

二向色镜（Dichromatic）

二向色镜作为一个滤光片（Filter）可将荧光中掺杂的激光分离出来，以便于荧光的后续处理。

XY扫描镜组（Scanner）

由一个或多个反射镜组成的镜组，用于引导聚焦后的激光在样本上进行点对点（Pixel-by- pixel）和行对行（Line- to- line）的扫描。

针孔（Pinhole）

用于提高共聚焦显微镜的层析能力，可滤除焦点以外的荧光信号。

应用

如下图所示，使用激光共聚焦显微镜对花粉进行3D成像，激发光源为488纳米激光，通过将一张张光学切片按顺序重构可以得到下图所示的三维图像。

Time Lapse（延时功能）