氯霉素气相色谱含量（液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中氯霉素残留量的研究）

氯霉素因对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很强的活性，表现出广谱的抗菌能力，广泛地应用于动物养殖业。由于它能导致人体产生再生障碍性贫血和溶血性贫血等毒副作用，欧盟、美国等先后将其定为禁用药物，不得用于畜牧养殖业中，虽然它们在动物体内残留量低 ，但毒副作用依然存在。饲料一般是兽药添加的主要载体，开展饲料中氯霉素测试从源头进行兽药残留控制的有效方法，因此研究配合饲料中氯霉素检测的方法具有重要的意义。

目前国内外关于组织中氯霉素的残留检测方法已很成熟，主要采用酶联免疫法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质联法。由于饲料的品种较多，组成复杂，使用普通的检测仪器测定其药物残留基质干扰较大，本文利用液相色谱-串联质谱的强选择性和抗干扰能力特点，建立了饲料中氯霉素残留的快速定性定量方法，定量限为0.3μg/ kg远远低于GB/T 21108-2007规定的限量，对配合饲料生产和畜牧养殖具有指导意义。

一、 实验部分

1、仪器与试剂

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra ENR串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；C18柱（150mm×3.1mm i.d.,3.5 µm ,Agilent）。

甲醇为色谱纯，乙酸乙酯、正己烷、氯化钠均为分析纯，水为去离子水。氯霉素标准品均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度≥98%，氘代氯霉素（chloramphenicol-D5）购自WITEGA Laboratorien Beelin-Adlershof GmbH公司，用甲醇溶解并配制成1.0㎎/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当浓度的混合标准工作液，4℃避光保存。

2、样品前处理

称取2.00±0.05 g 饲料于50mL 具塞离心管中，加入4 mL水，于涡旋混合器上混匀30 s后静置10 min待饲料浸润，加入10 mL氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，v/v ，98：2），于涡旋混合器上快速混匀30 s，超声波提取10 min；以8000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至50 mL梨形瓶中，于45℃水浴中减压浓缩至干，用1 mL甲醇/水（v/v 2：8）溶解残留物，加入1 mL正己烷净化脱脂，离心后取下层，经0.45 µm滤膜过滤，滤液供液相色谱-串联质谱仪测定。

3、液质联用仪分析条件

3.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150mm×2.1mm i.d.,3.5 µm ）；进样量：25μL；柱温：30℃；流动相：A去离子水，B甲醇；梯度洗脱条件：0～4 min A 70%；4.1～6.5 min A 20%；6.6～8.5 min A 70%；流速：250μL/min。

3.2质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，喷雾电压2500V，多反应监测（MRM）方式检测，

二、 结果与讨论

1、提取条件的优化

氯霉素属于弱极性物质易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，可以通过这些溶剂提取。乙酸乙酯对氯霉素的提取效率最高，适合于动物组织样品的提取，又有文献报道碱化乙酸乙酯对虾等水产品有更好的回收率。由于配合饲料组成复杂含有大量的脂肪、蛋白质、纤维素、矿物质等复合组分，本研究比较了上述几种溶剂及碱化乙酸乙酯提取效率，结果表明碱化乙酸乙酯提取效率优于其他几种常见试剂，实验对碱化乙酸乙酯的浓度进行优化，实验表明当乙酸乙酯/25%氨水(v/v,98:2)时提取效率及稳定性最好，随着氨水比例提高提取效率没有提高，反而对提取的基质干扰越大；同时饲料样品的水分很少，在提取前充分润湿有利于目标物的提取，提高回收率。

2、样品的净化

碱化乙酸乙酯提取效率虽高，但提取的非极性脂溶物较多，基质干扰较大，需要进一步净化。GB/T 21108-2007和文献报道的净化方法用甲醇和4 %氯化钠溶液溶解目标物，正己烷净化脱脂两次，乙酸乙酯进行液-液分配萃取净化，再过SPE固相萃取柱净化。本研究的方法：在1 mL甲醇/水（v/v 2：8）溶解残留物后用1 mL正己烷净化脱脂，可以有效的去除基质干扰，省去固相萃取过程，缩短样品前处理时间。

3、 线性范围、检出限和定量限

配制6个不同质量浓度的标准溶液，溶液中氯霉素、为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL ，氘代氯霉素-D5的质量浓度为5.0 ng/mL，在本法所确定的实验条件下进样，测定其峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积的比值(氯霉素峰面积/氘代氯霉素-D5 面积)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程、相关系数。在空白配合饲料基质中添加氯霉素标准品，以信噪比（S/N）≥3时的含量定为方法的检出限（LOD）；以信噪比（S/N）≥10时的含量定为方法的定量限（LOQ），氯霉素的检出限和定量限，其相应的MRM色谱图，标准溶液的MRM色谱图。

4、 回收率和精密度

选取阴性配合饲料样品，添加氯霉素标准品和内标，氯霉素标准品添加水平为0.3 μg/ kg、1.0 μg/ kg、5.0 μg/ kg，氘代氯霉素-D5 5.0 μg/ kg，每个添加5次平行，回收率平均在89.7%-105.6%之间，相对标准偏差(RSD)小于8.7% 。

三、 结论

本文建立了配合饲料中氯霉素测定的高效液相色谱-串联质法。串联质谱和同位素内标的使用消除了配合饲料复杂基质的影响，提高定量的准确性。该方法操作简便，省去固相萃取步骤，缩短检测周期，灵敏度较高，回收率较好。

作者：魏云计