细胞的边界及组成成分（细胞的传代纯化）

首先是实验步骤：

1.培养液配置

2.细胞传代

3.培养液更换

4.细胞冻存

其中最主要的部分就是进行细胞传代。

什么是细胞传代？

1.传代培养是指将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

2.传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面因细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

为什么需要进行细胞传代？

1.增加细胞数量

进行不同环境和条件下的细胞培育试验，替换不良和坏死细胞，保持细胞活性。

2.防止细胞中毒和死亡

因为细胞会在培养皿中不断繁殖直到营养物消耗完或代谢物过度堆积，为了保证细胞可以继续繁殖，需要在细胞密度达到80%-90%的时候进行传代处理。如果不进行传代， 细胞会因为培养皿中培养物耗尽， 代谢物过度堆积，ph值降低等问题而中毒和死亡。

3.纯化细胞

淘汰培养出来的细胞里的占比不大的细胞类型，纯化最终的细胞类型。

实验细胞需要怎样的生存环境？

细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同，需要四项基本条件。

1、无污染环境

无毒和无菌的培养环境是保证细胞生存的首要条件。放置于体外培养的细胞相较于体内细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

2、恒定的温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃（±0.5℃），偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃中1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复;在40-41℃中1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复;41-42℃中1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。

3、气体环境

气体是人体细胞培养生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气和5%二氧化碳混合气体环境中。

二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。

细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞的无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变化的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。

4、细胞培养基

培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类;按其来源分为合成培养基和天然培养基。

(1)合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的，内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽能生存但不能很好的生长增殖。

(2)天然培养基：最普遍的天然培养基是血清，其中小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促粘附因子及其多种活性物质,与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。

具体要细胞传代要怎么做呢

实验前，试剂(培养基，胰酶和PBS)提前30min放入水浴锅加热。

实验尽可能保证无菌操作，用75%乙醇清洁双手后打开生物安全柜，所有实验操作不可离开生物安全柜使细胞中间的连接断开方便之后形成单细胞悬液。

备注：单细胞悬液，指把贴壁培养的细胞消化吹打以后形成的悬液。

1. 细胞密度达到80-90%时传代

2. 准备好：完全培养液、胰酶、PBS（岔开放置，防止污染）。随时用酒精灯烧。准备离心管、不同大小培养皿

3. 吸走旧培养液，加2-3mlPBS冲洗1-3遍，弃PBS

4. 沿壁加1ml0.25%胰蛋白酶（打断细胞间连接），调枪头到3ml

5. 在显微镜下观察，当细胞间隙开始变大时，立即加入3ml培养液，终止消化

6. 用枪吸培养液，不同角度垂直吹打，细胞形成的白膜被吹打下来，形成单细胞悬液，收集在离心管中。

7. 900rpm，5min离心重悬，弃上清，可用枪头吸残余液体

8. 加1ml培养液，吹打40次，枪头不出液面

9. 中皿中加3.65ml培养液；小皿加几个玻璃片，晃开，再加1.5ml培养液

10. 中皿加350μl离心管中细胞，前后左右晃匀；小皿100-170μl

11. label，放置在培养箱保存

备注：在细胞空隙变多且空隙分散随机，大小均匀时，加培养液停止消化后形成单细胞悬液，收集在离心管中。因为密度不同，细胞最后会沉淀附着在离心管底。配合移液枪去除液体，加入培养液吹打形成新的单细胞悬液，后形成新的一代细胞。

注意：细胞因为老化和在繁殖中的变异，一般只使用40代，并且在完成操作之后12h内不可剧烈摇晃使新细胞脱离培养皿底。后续实验中需要小皿，此时在皿底放7-8个玻璃盖片并且铺散避免重合，培养液和细胞各加1.5mL和175uL。

除传代之外，细胞还需要不定期更换培养液来清理悬浮着的死亡细胞和代谢物。

（二）复苏

1. 液氮冻存处取

2. 拧紧瓶盖

3. 37℃水浴锅，剧烈晃动，直至完全溶解，瓶盖口避免水和手的触碰

4. 75%酒精充分消毒瓶盖口

5. 准备10ml离心管，转移全部细胞，约1ml

6. 加4ml培养基

7. 离心

8. 中皿培养基加4ml

9. 离心的，观察离心量有多少，少的就不要了

10. 倒掉培养液，用枪头吸取多余的液体

11. 从中皿中吸取1ml培养基加入离心管，反复吹打，加入培养基

12. 晃动培养皿，培养箱培养

（三）冻存

1. 传代离心后

2. 加入1ml冻存液，吹打均匀

3. 放入冻存的瓶子里

4. -70℃冻存1-2天

5. 之后转移到液氮罐中

在生物细胞学研究中，有时需要体外培养和分析癌细胞。细胞要养好，就要用好血清，如Ausbian®特级进口胎牛血清，它的内毒素小于3Eu/ml，使细胞更健康，客户做实验更加顺利。

文章来源于：Heartinker

本文所用图片及内容均来源于网络收集整理，仅供学习交流，版权归原作者所有，并不代表我站观点。本站将不承担任何法律责任，如果有侵犯到您的权利，请及时联系我们删除。

,