怎样防止姜瘟病（不同处理对高山凤头姜姜瘟病的防效及土壤细菌群落结构的影响）

不同处理对高山凤头姜姜瘟病的防效及土壤细菌群落结构和功能的影响

胡洪涛1 朱志刚1 杨靖钟*1 曹坳程*2 颜冬冬2

1 湖北省生物农药工程研究中心 湖北 武汉 430064

2 中国农业科学院植物保护研究所 北京 100193

摘 要：【背景】凤头姜是湖北西部山区来凤县著名的国家地理标志性产品，但由于姜瘟病的流行且无经济有效的防控方法，导致其播种面积和总产值急剧下滑，姜瘟病已成为制约凤头姜产业振兴的关键因子。【目的】研究高山凤头姜姜瘟病防控技术及其对高山土壤微生态的影响。【方法】通过田间试验评价了棉隆土壤消毒(T1)、生防菌34107 灌根(T2)、棉隆土壤消毒联合生防菌34107 灌根(T3)、中生菌素灌根(T4)、对照(T5)等5 种处理对高山凤头姜姜瘟病的防控效果。同时，提取了上述处理土壤基因组DNA，利用Illumina MiSeq 平台对细菌16S rRNA 基因V3–V4 区进行了高通量测序。【结果】在所有处理中，以T3 处理对凤头姜姜瘟病的防效最好(96.1%)，高于T1 (86.5%)，且显著高于T2 (75.2%)和T4 (54.8%) (P<0.05)。产量和纯收入以T3 为最高，其次为T1、T2 和T4，而T5 产量和纯收入最低且纯收入为负值。高通量测序共获得608 070 条高质量的16S rRNA 基因序列，简并后得到9 243 个分类单元(operational taxonomic unit，OTU)；各处理土壤细菌在门水平群落结构与对照非常相似，但部分分类单元丰度发生较大改变。土壤细菌α 多样性分析结果显示，T1−T4 处理Shannon和Simpson 指数均显著高于T5 (P<0.05)，而除T2 处理外，其余3 个处理Chao1 指数均显著高于T5(P<0.05)；ACE 指数以T3 处理最高，高于T1 和T4 处理、显著高于T2 和T5 处理(P<0.05)。相比T5，总共25 个门水平的OTU 丰度发生显著改变(P<0.05)，且大部分丰度有所增加；总共有159 个属水平的OTU 发生显著性改变(P<0.05)，其中50.9%在4 个处理中均发生显著性改变，仅有少数OTU在单个处理中改变显著性。丰度前10 的属中，植物病原菌所属的雷尔氏菌属(Ralstonia)和软腐菌属(Pectobacterium)丰度在T1−T4 中均显著下调(P<0.05)，而有益菌，如芽孢杆菌属(Gemmatimonas)、放线菌(Jatrophihabitans)等则有不同程度的增加。土壤细菌OTU 共映射到6 055 个KEGG 功能通路，其中与亚硝酸盐还原酶相关的通路在4 处理中均显著下调(P<0.05)，与氮固定相关的通路则不同程度上调，与一氧化二氮还原酶相关的通路在T3 和T4 处理中下调而在T1 和T2 处理中上调。KEGG功能通路富集到41 个代谢通路模块，其中与氨基酸和碳水化合物代谢的丰度最高，且大部分在T3处理中丰度最高。【结论】棉隆土壤消毒联合生防菌34107 处理能有效控制高山凤头姜姜瘟病，同时

能增加土壤细菌微生态多样性和有益菌丰度，本研究为高山土壤微生态修复及重建技术和理论的发展奠定了基础。

关键词：凤头姜，姜瘟病，棉隆，土壤消毒，生物防控，微生物多样性，KEGG 功能通路

姜瘟病是生姜细菌性青枯病(bacterial wilt of ginger)的俗称[1-2]，其发病快死亡率高、经济损失大。细菌性青枯病由于缺乏经济有效的防控措施，也被称为植物的“癌症”。细菌性青枯病病原为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，青枯菌)[3]，该菌在世界上广为分布，能侵染50 多个科300 多种植物，其许多寄主是重要的经济作物，包括番茄、辣椒、茄子、烟草、马铃薯等[4-5]，鉴于该菌的危害性和所致经济损失严重，而被列为世界十大植物病原细菌之一[6]。同时，该菌在我国大部分地区均有发现[7]，且寄主种类多，已成为我国农业可持续发展的关键制约因子。青枯菌主要习居于土壤，在逆境或缺乏寄主时，能以所谓的非可培养活细胞状(viable but not culturable，VBNC)存活[8-9]，据报道该菌在土壤中可存活长达10 年之久。土壤带菌是生姜青枯病主要初侵染源，因此，消灭土壤中病原菌是防治生姜青枯病的关键。众多研究表明土壤消毒控制土传性病害效果最好，土壤消毒又称土壤熏蒸，是采用化学、物理、生物等方法[10-14]杀灭土壤中有害生物，从而达到控制土传病虫害发生、保障农业生产可持续发展的目的。在所有土壤消毒的措施中，尤以化学药剂溴甲烷消毒效果最好，但因其对臭氧层破坏而被全球禁用，研究和发展溴甲烷的替代品成为控制土传性病害的关键[11]。研究较多的溴甲烷替代品有氯化苦、棉隆等，其中棉隆因其毒性低、操作便利、环境友好等特性而在许多地方推广。棉隆在土壤中遇水能迅速分解成甲胺基甲基二硫代氨基甲酸酯，并进一步生成异硫氰酸甲酯[11]，从而杀灭土壤中有害生物，包括线虫、真菌、细菌和杂草等。尽管土壤消毒防治土传性病害的效果突出，但因其对土壤中的生物均有杀灭作用，对微生物的结构和功能有一定影响[12]，其应用一直备受争议。

众多的报道指出棉隆土壤消毒技术能有效控制土传性病害的发生，如黄瓜根结线虫[13]、番茄茎基腐病[14]、根肿病[15]等，但是绝大多数研究仅限于线虫或真菌病害，而对细菌性病害的防控效果研究较少，尤其是对生姜姜瘟病防治效果的研究不多，更缺乏高山生姜姜瘟病的防控效果的研究。凤头姜是湖北恩施州来凤县著名国家地理标志性产品，曾经播种面积高达3 400 hm2，然而由于长期连作，导致姜瘟病流行且无经济有效的防控措施，致使凤头姜大面积死亡，播种面积萎缩80%，目前只有740 hm2左右，姜瘟病已经成为制约凤头姜产业发展的关键因子。为科技支撑贫困山区产业发展、实现凤头姜产业振兴，我们通过田间试验评价棉隆土壤消毒、生物防控、土壤消毒联合生物防控、化学防控等方法对凤头姜姜瘟病防控效果，同时采用Illumina MiSeq 高通量测序技术评价不同处理对土壤细菌微生物多样性及其群落结构和功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地点位于湖北恩施州来凤县绿水镇周家湾村，试验田连续种植了3 年生姜，上季姜瘟病发生较为严重。

1.2 主要试剂和仪器

土壤基因组试剂盒FastDNA Spin Kit for Soil，北京索莱宝科技有限公司；Q5 高保真DNA 聚合酶，NEB 公司；5×反应缓冲液、5×高GC 缓冲液、dNTPs，Thermo Fisher Scientific 公司；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina 公司。

电泳仪，北京六一生物科技有限公司；PCR 仪和凝胶成像仪，Bio-Rad 公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度计，赛默飞公司；Illumina MiSeq 双端高通量测序平台，Illumina 公司。

1.3 试验处理

试验共5 个处理，分别是98%棉隆微粒剂土壤消毒(T1)、生防菌34107 (0.2 亿/mL 孢子青霉菌剂)灌根(T2)、98%棉隆微粒剂土壤消毒并联合生防菌34107 灌根(T3)、3%中生菌素灌根(T4)和空白对照(T5)。98%棉隆微粒剂为江苏南通施壮化工有限公司所生产含量，土壤消毒方法按照NY/T3129《棉隆土壤消毒技术规范》要求进行，用量为450 kg/hm2，土壤处理时间为2018 年3 月10 日，揭膜时间为3 月25 日，4 月5 日栽姜。生防菌34107为湖北省生物农药工程研究中心试验样品，按照600 kg/hm2 量进行灌根，整个生长季共灌根3 次，每次用量为200 kg/hm2，时间分别为5 月10 日、6 月8 日和7 月15 日。3%中生菌素为福建凯立生物制品有限公司生产，按63 kg/hm2 用量分3 次进行灌根，时间同T2 处理。每个处理设3 个重复，每小区面积为150 m2，小区随机排列。

1.4 结果调查

在生姜收获时(2018 年9 月30 日)，按照NY/T1464.31《农药田间药效试验准则第31 部分：杀菌剂防治生姜姜瘟病》的要求调查姜瘟病病情指数，同时采集生姜根茎附近土壤用于提取土壤微生物总DNA。

1.5 土壤细菌16S rRNA 基因高通量测序

土壤总基因组DNA 提取后，经0.8%凝胶电泳和NanoDrop 2000 超微量分光光度计检验合格后，对细菌16S rRNA 基因的V3−V4 区进行PCR 扩增，扩增上游引物为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3′)，下游引物为806R (5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)。PCR反应体系(25 µL)：Q5高保真DNA聚合酶0.25 µL，5×反应缓冲液5 µL，5×高GC 缓冲液5 µL，dNTPs (10 mmol/L) 2 µL，模板DNA 2 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，ddH2O 8.75 µL。PCR 反应条件：98 °C 30 s；98 °C 15 s，50 °C 30 s，72 °C 30 s，27 个循环；72 °C 5 min。扩增产物采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，然后采用Illumina MiSeq 双端高通量测序平台进行测序。

1.6 数据分析

Illumina MiSeq 原始双端测序数据为FASTQ 格式，首先采用窗口滑动法对序列进行质量过滤，以10 bp (base pair，碱基)为窗口、1 bp 为步长进行滑动，窗口内的碱基质量要求大于或等于Q20，且质量过滤后的序列长度大于150 bp。经质量过滤的序列，采用FLASH 软件进行双端拼接，要求重叠区大于或等于10 bp 且无错配，并采用QIIME 软件[16]检查并剔除含有模糊碱基或嵌合体的序列。然后，采用QIIME 软件中的UCLUST 序列比对工具，将过滤后的序列与GreenGenes 数据库中的16S rRNA基因序列进行比对，以97%的相似性作为阈值进行OTU 划分。

1.7 土壤细菌多样性计算

细菌多样性指数、Simpson、Chao1、ACE 和Shannon 指数计算方法，分别参照文献[17-20]。

1.8 土壤细菌功能预测

采用PICRUSt[21]方法对测序所得的土壤微生物OTU 与数据库进行比对，然后映射到KEGG[22]数据库，对基因功能进行预测和分析。

1.9 统计学检验

使用Mothur[23]软件，调用MetaStats[7]的统计学算法对不同处理的细菌各分类单元的序列量差异进行两两比较检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对生姜青枯病防效、产量及经济效益分析

不同处理对生姜青枯病防效、产量及经济效益分析详见表1。由表1 可见，同对照(T5)比较，无论是棉隆消毒(T1)还是棉隆消毒联合生物菌剂(T3)等处理，均能显著降低凤头姜姜瘟病病情指数(P<0.05)，其中以T3 处理病情指数最低(1.4)而校正防效最高(96.1%)，其次为T1 (病情指数4.9，校正防效86.5%)，随后为T2 (病情指数9.1，校正防效75.2%)和T4 (病情指数16.6，校正防效54.8%)，T3和T1 校正防效无显著差异(P>0.05)，但这二处理校正防效显著高于T2 和T4 (P<0.05)。

测产结果表明，以 T3 处理生姜产量最高(32 427.5 kg/hm2)，显著高于其他3 个处理(P<0.05)；其次为T1 处理(28 043 kg/hm2)，显著高于T2(21 383.5 kg/hm2)和T4 处理(13 971 kg/hm2) (P<0.05)。以T3 处理产值最高(181 594 Yuan/hm2)，显著高于其他3 个处理；T1 处理产值次之(157 040.8 Yuan/hm2)，随后为T2 处理(119 747.6 Yuan/hm2)、最低为T5 处理(17 945.2 Yuan/hm2)。扣除药剂、种姜等成本，以T3 处理纯收入最高，为116 134.0 Yuan/hm2，显著高于T1 (104 690.8 Yuan/hm2)、T2 (79 787.6 Yuan/hm2)和T4 处理(30 762.6 Yuan/hm2)，而T5 处理产量最低而纯收入为−25 404.8 Yuan/hm2。

表1 不同处理对生姜青枯病防效及经济效益分析Table 1 Control effects of different treatments on bacterial wilt of ginger and profit analysis

注：T1 和T3 处理由于无需人工除草，扣除人工除草费用8 250 Yuan/hm2；不同小写字母表示各处理在0.05 水平上表达差异显著. /: 无.Note: Because the treatments of T1 and T3 had no need to control weed by labor, the labor cost of 8 250 Yuan/hm2 for weed control was deducted; the lowercase letters represented significant difference at 0.05 level. /: No data.

2.2 高通量测序与OTU 划分与鉴定

Illumina MiSeq测序数据经剔除低质量序列后，共得到608 070 条高质量细菌16S rRNA 基因V3−V4 序列，平均每个文库的序列量为40 538±4 802 条，99.8%的序列长度在400−450 bp 之间。通过序列比对和OTU 划分，共得到9 243 个OTU，其中543 (5.87%) OTU 为5 个处理所共有，592−1 238 个OTU 仅在单个处理检出，约占总量的6.40%−13.39%。

不同处理土壤细菌在门水平的分类学组成见图1。由图1 可见，不同处理的土壤细菌在门水平的组成非常类似，均以变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)相对丰度为最高，3 个门总相对丰度达到56.6%−73.8%。相对于T5，各处理变形菌门的相对丰度较对照均大幅下降，幅度为41.8%−49.3%，且在T2、T3 和T4 处理中显著下降(P<0.05)；而酸杆菌门在T1−T4 处理中均显著增加(P<0.05)，增幅为178.6%−401.6%。除T2 外，放线菌门其余处理中的相对丰度均大幅增加，增加幅度为13.5%−46.8%，但除 T3 外，其余处理与 T5 比较差异不显著(P>0.05)。

图1 不同处理土壤细菌在门水平组成Figure 1 Composition of soil bacteria in different treatments

2.3 不同处理对土壤细菌α 多样性的影响

不同处理对土壤细菌α 多样性的影响见图2。Simpson 指数以T3 (0.997 7)和T1 处理(0.997 2)为最高，显著高于T4 (0.995 7)、T2 (0.995 4)和T5 处理(0.973 0)。Chao1指数以T3 (3 223)为最高，与T1 (2 950)和T4 处理(2 801)无显著性差异(P>0.05)，但显著高于T2 (2 284)和T5 (2 299) (P<0.05)。ACE 指数也是T3 处理(3 363.2)为最高，其次为T1 (3 069.4)、T4(2 847.3)、T5 (2 354.6)和T2 (2 351.4)。Shannon 指数以T4 处理(10.26)为最高，显著高于T1 (9.91)、T2 (9.64)和T3 (9.60)处理(P<0.05)，且T1−T4 处理Shannon 指数均显著高于T5 处理(P<0.05)。

图2 不同处理土壤细菌α 多样性Figure 2 The alpha diversity of soil bacteria in the soils by different treatments

注：A、B、C 和D 分别是Simpson、Chao1、ACE 和Shannon 指数；图中相同字母代表在0.05 水平无显著性差异，而不同字母代表显著性差异.Note: A, B, C and D represent Simpson, Chao1, ACE and Shannon indexes, respectively; The same letters in the figures represent no significant difference at 0.05 level, while different letters represent significant differences.

2.4 不同处理对土壤细菌群落结构和组成的影响

采用MetaStats 方法，对不同处理土壤中细菌丰度变化进行了两两比较，不同处理对土壤细菌在门水平的影响详见图3。同T5 比较，共有25 个门水平的OTU 发生显著性改变(图3A)，根据其表达趋势，可以分为4 个不同的组(C1、C2、C3 和C4)。C1 组包含 4 个门水平 OTU (Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Actinobacteria 和Acidobacteria)，均相对于T5 丰度增加(图3B)；C2 组包括4 个门水平OTU (Firmicutes、Planctomycetes、Nitrospirae、Saccharibacteria)，其丰度相对T5 也明显增加(图3C)；C3 组包含13 个门水平OTU (Chlorobi、Elusimicrobia、Latescibacteria、FCPU426、GAL15、Chlamydiae、TM6_(Dependentiae)，WS2、BRC1、Euryarchaeota、Lentisphaerae、Armatimonadetes、Parcubacteria)，相对于T5 丰度也明显增加(图3D)；C4 组包含 4 个门水平 OTU (Fibrobacteres、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria)，其丰度相对于T5 明显下降(图3E)。

MetaStats 分析两两比较结果发现，总共159 个属水平的OTU 丰度发生显著改变(P<0.05) (表2)。各处理(T1−T4)相对与对照(T5)，分别有125 (78.6%)、119 (74.8%)、120 (75.5%)、124 (78.0%)个属水平的OTU 发生显著变化(表2)；其中分别有63 (39.6%)、55 (34.6%)、64 (40.3%)、59 (37.1%)个OTU 显著上调，62 (39.0%)、64 (40.3%)、56 (35.2%)、65 (40.9%)个OTU 显著下调。

图3 不同处理土壤细菌丰度发生显著性改变的门水平OTUFigure 3 OTUs at phylum level of soil bacteria whose abundances were significantly changed in different treatments

注：A：热图显示土壤细菌丰度发生显著改变的在门水平OTUs；B−D：C1−C4 组中不同处理细菌门水平OTU 丰度；图中颜色代表OTU 丰度，红色丰度高、绿色丰度低.Note: A: Heat map exhibiting OTUs of soil bacteria at phylum level that were significantly changed; B to D: The abundance of bacterial OTUs in different treatments in clades C1 to C4, respectively；The colors represent the OTU abundance: Red and green representing higher and lower abundances, respectively.

表2 不同处理土壤细菌属水平OTU 丰度发生显著改变的数量Table 2 Numbers of OTUs at the genus level significantly changed in different treatments

发生显著改变属水平OTU 交集详见图4。在T1–T4 处理中，分别仅有4 (2.5%)、3 (1.9%)、7 (4.4%)和5 (3.1%)个OTU其丰度仅在单个处理中显著性改变；7 (4.4%)、7 (4.4%)、7 (4.4%)、6 (3.8%)、4(2.5%)个OTU 分别在T1-T2、T1-T3、T1-T4、T2-T3、T3-T4 处理中同时发生显著性改变；有1 (0.6%)、12 (7.5%)、6 (3.8%)、8 (5.0%)分别同时在T1-T2-T3、T1-T2-T4、T1-T3-T4、T2-T3-T4 中发生显著性改变；而有81 (50.9%)个OTU 在4 个处理中均发生显著改变(图4)。

发生显著改变的属水平前10 位OTU 丰度详见图5。在T1−T4 等4 个处理中，6 个属水平OTU(Ralstonia 、 Pectobacterium 、Cellvibrio 、Flavobacterium、Arthrobacter、Arcobacter)均显著下调(P<0.05)，其中 Ralstonia、Pectobacterium 和Acrobacter 包含了青枯病、软腐病、动物菌血症病原菌，而其余 4 个属 OTU (Sphingomonas、Mizugakiibacter、Gemmatimonas、Jatrophihabitans)相对于对照则有不同程度的增加。

图4 不同处理中属水平发生显著改变的OTU 交集Figure 4 The intersection of OTUs at the genus level that were significantly changed in different treatments

Note: The lowercase letters in the figure represented different intersections; The numbers represented the amount in corresponding intersections. a (T1): Mesorhizobium, Pusillimonas, Sporocytophaga,Jeotgalicoccus; b (T1∩T2): Blastococcus, Rhodoplanes, Nakamurella,Massilia, Chryseobacterium,Aquamicrobium, Luedemannella; c(T2): Gaiella, Nocardioides, RB41; d (T1∩T3): Modestobacter,Aquincola, Undibacterium, Crenotalea, Conyzicola,Asticcacaulis,Devosia; e (T1∩T2∩T3): Sorangium, Actinospica, Micromonospora,Singulisphaera, Dyella, Granulicella; f (T2∩T3): Noviherbaspirillum,Phormidium, Arthronema, Rhizobium, Roseateles, Mucilaginibacter; g(T3): Lysinimonas, Heliimonas, Minicystis, Spirosoma,Bryum_argenteum_var._argenteum, Streptomyces, Chthoniobacter; h(T1∩T3∩T4): Sorangium, Actinospica, Micromonospora,Singulisphaera, Dyella,Granulicella; i (T1∩T2∩T3∩T4): Reyranella,Anaerolinea, Brevundimonas, Burkholderia-Paraburkholderia,Haliangium, Flavitalea, Isosphaera, Pseudomonas,Hydrogenophaga,Sphingobacterium, Ralstonia, Opitutus Pedobacter, Acidobacterium,Leptospirillum, Acidothermus, Pseudorhodoferax,Delftia,Microbacterium, Hamadaea, Gemmatirosa, Verrucosispora,Variibacter, Jatrophihabitans, Polycyclovorans, Terrabacter,Lachnoclostridium_5, Kaistia,Nitrolancea, Comamonas, Fluviicola,Arcobacter, Stenotrophomonas, Caulobacter, Citrobacter,Luteimonas, Conexibacter, Tahibacter,Flavobacterium,Arthrobacter, Nannocystis, Azospirillum, Candidatus,_Solibacter,Bdellovibrio, Pseudolabrys, Leucobacter, Bryobacter,Roseiarcus,Mizugakiibacter, Sphingomonas, Paenibacillus, H16, Acidovorax,Anaeromyxobacter, Siphonobacter, Cellvibrio, Geodermatophilus,Gemmatimonas,Rhizomicrobium, Nubsella, Pseudoclavibacter,Inhella, Herminiimonas, Aquicella, Bacteriovorax, Myroides,Lachnospiraceae_NC2004_group, Streptacidiphilus,Leadbetterella,Acidibacter, Aeromonas, Rhodanobacter, Escherichia-Shigella,Phenylobacterium, Nitrobacter, Paenarthrobacter,Enterobacter,Sediminibacterium, Pectobacterium, Catenulispora, Acidicaldus; j(T2∩T3∩T4): Xanthomonas, Pseudohongiella, Candidatus_Koribacter,Enterococcus, agricultural_soil_bacterium_SC-I-84 CL500-29, Roseiflexus, Achromobacter; k (T3∩T4) : Mycobacterium,Bradyrhizobium, Lapillicoccus,Methylobacterium; l (T1∩T4) :Ochrobactrum, Sphingobium, Ottowia, Pseudarthrobacter, Variovorax,Pantoea, Caenimonas; m (T1∩T2∩T4) : SM1A02,Prosthecobacter,Acinetobacter, Iamia, Parcubacteria_group_bacterium_GW2011_GWA1_60_11, Duganella, Arenimonas, Bacillus, Bosea, Dongia,Dyadobacter,Paludibacterium; n (T2∩T4): Nitrospira; o (T4):Sphingopyxis, Cytophaga, Persicitalea, Holophaga, Ensifer.

2.5 不同处理对土壤细菌群落功能的影响

图5 前10 位丰度显著改变的属水平OTUFigure 5 Top 10 OTUs at genus level that were significantly changed

注：图中相同字母代表在0.05 水平无显著性差异，而不同字母代表显著性差异.Note: The same letters in the figures represent no significant difference at 0.05 level, while different letters represent significant difference.

图6 不同处理对土壤细菌氮代谢相关KEGG 功能通路丰度Figure 6 The abundance of KEGG pathways of soil bacteria related to nitrogen metabolism in different treatments

Note: A: Nitrite reductase; B: Nitrogen fixation protein; C: Nitrogenase; D: Nitrous oxide reductase.

对土壤微生物基因功能进行分析，细菌OTU共映射到6 055 个KEGG 通路，其中与氮代谢相关基因和蛋白质的功能通路丰度详见图6。同T5 比较，T1-T4 处理能有效减少亚硝酸盐还原酶功能通路的丰度(P<0.05)，以T4 处理的丰度减少最多(54.2%)，其次为 T2 (50.6%)、T3 (34.1%)、T1(33.4%)。固氮蛋白功能通路丰度在4 个处理中均有不同程度增加，以T3 处理增加最多(53.7%)，其次为T4 处理(35.3%)、T1 (16.7%)、T2 (15.2%)。固氮酶功能通路丰度在T1-T3处理中显著增加(P<0.05)，以 T2 增幅最大(76.3%)，显著高于其他处理(P<0.05)，而T4 处理与T5 无显著差异(P>0.05)。一氧化二氮还原酶功能通路在T3 和T4 处理中减少，而在T1 和T2 中有不同程度增加。

这些功能通路富集到41 个KEGG 代谢通路模块(图7)，分属于7 类调控网络：细胞的过程(cellular process)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、人类疾病(human diseases)、代谢(metabolism)、器官系统(organismal systems)、未分类(unclassified)。在41 个代谢通路模块中，以与氨基酸代谢(amino acid metabolism)和碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)丰度最高，膜转运(membrane transport)次之，而以细胞通讯(cell communication)和感应系统丰度最低(sensory system)。大部份代谢模块丰度在T3 中最高、T1 次之，而在其他几个处理中相对较低。

图7 不同处理土壤细菌KEGG 代谢通路模块丰度Figure 7 The abundance of KEGG metabolic pathways of soil bacteria in different treatments

注：图中颜色代表通路模块丰度，红色丰度高、绿色丰度低.Note: The colors represent the abundance of pathway modules; red and green representing higher and lower abundances, respectively.

3 讨论与结论

生姜是我国乃至东南亚地区广为种植的蔬菜品种之一，在我国南北均广泛种植，并在栽培过程中逐渐形成多个各具特色的名优地方品种。凤头姜作为湖北山区来凤县的名牌地理标志性产品，栽培历史长达300 多年，以其富硒多汁、无筋嫩脆、营养丰富而成为全国名产，产量曾高达4.5×107 kg，是贫困山区的农业产业支柱。由于长时间连作，姜瘟病在产区流行，导致生姜大面积死亡，为抑制姜瘟病的发生，当地多采用水旱轮作模式，即种植一季水稻，来年种植一季生姜，从而规避姜瘟病的暴发。然而，种植水稻经济收入较低、拉低整体经济收入，且水旱轮作对姜瘟病抑制效果有限，导致凤头姜种植面积急剧下滑约80%，产业发展受到极大限制，解决姜瘟病防控难题已成为山区产业发展和乡村振兴的关键。

姜瘟病的防控方法通常可分为生物防控、化学防控、土壤消毒等，在我国正式登记的防治姜瘟病的药剂有5 种，包括3 种化学药剂(氢氧化铜、噻森铜、硫酸铜)和2 种生物药剂(蜡质芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌)[24]，但实践中应用并不多。也有报道称采用太阳能消毒辅以钙肥或地衣芽孢杆菌能有效降低土壤青枯菌种群数量，防治效果接近100%[25]。凤头姜一般在春季4 月5 日前后种植，但此时且恰逢山区春季多雨季、阳光少，无法实施太阳能消毒。尽管土壤消毒在平原或设施蔬菜种植区域应用效果较好，但是山区具有与平原地区迥然不同的土壤性质和气候环境，土壤消毒能否在山区应用仍待实践检验。我们曾利用棉隆成功防治高山甘蓝根肿病的研究、证明了高山地区使用棉隆土壤消毒的可行性[15]的基础上，继续尝试采用棉隆防治高山凤头姜姜瘟病。试验结果显示，采用棉隆土壤消毒结合生物防治，能有效地防治凤头姜姜瘟病，防治效果达到96.1%，高于棉隆防效、显著高于生物和化学防控防效，产量是中生菌素处理2 倍多，同时经济效益相当显著，并且田间基本不用人工除草，节约大量劳动力投入。

化学药剂土壤消毒是一种灭生性的方法，对土壤生物靶标无选择性，这导致其一直饱受争议，实际应用也受到限制。为阐明土壤消毒对高山生姜土壤微生态的影响，我们采用Illumina MiSeq 方法研究不同处理条件下土壤微生物群落结构和功能的变化。结果发现，无论是土壤消毒、还是生物防控或是化学防控，其土壤微生物群落结构非常相似(图1)，其中有益菌数量如放线菌等，在土壤消毒处理中反而较单纯生物防控有大幅增加，说明无论是生物或化学方法，对高山生姜土壤细菌群落的影响相似，且土壤消毒有利于土壤有益菌的累积。α 多样性是衡量土壤微生物多样性的关键指标，同对照比较，4 种处理土壤中几乎所有4 种α 多样性指数均有不同程度增加(图2)，其中棉隆消毒联合生物防控处理的Chao1 和ACE 指数最高，显示4 种处理土壤微生物多样性均有不同程度改善，其中棉隆土壤消毒结联合生物防控微生物群落丰富度最高，说明该处理最有利于土壤微生态恢复。相对于对照，有25 个门水平OTU 发生显著变化，其中多数丰度为显著增加(图3)，提示4 种处理均有利于土壤微生物种群的恢复。属水平OTU 有159 个发生显著改变，其中50.9%在4 个处理中均显著上调或下调，尤其是青枯菌所属的雷尔氏菌属(Ralstonia)的丰度在各处理中显著下调，显示各处理能有效降低土壤青枯菌病原的数量(图5)，而同时生姜姜瘟病的病情指数相对于对照也有显著降低(表1)，说明土壤中的青枯菌的数量与病情指数之间存在着内在的联系，而降低土壤青枯菌数量对防控青枯病起到积极和关键的作用。除此之外，土传性软腐病病原所属的软腐菌属(Pectobacterium) 、 动物菌血症所属的Acrobacter 的丰度也显著下调(图5)，说明这4 个处理对环境中的病原菌有明显的抑制作用，提示这些方法有可能应用于防控其他土传性病害。另外，在对照土壤中，青枯菌与软腐菌的丰度都较高，提示这两种菌可能存在着相互作用，促进姜瘟病的发生与发展。相对于病原菌，土壤有益菌包括芽孢杆菌属(Gemmatimonas)、放线菌(Jatrophihabitans)等，则丰度显著增加，说明各处理土壤微生态朝健康方向发展。所有处理土壤中亚硝酸还原酶功能通路丰度均显著降低；棉隆土壤消毒结合生物防控和中生菌素处理土壤固氮蛋白功能通路丰度均显著增加；除中生菌素处理外，固氮酶功能通路丰度均显著增加，而一氧化二氮还原酶在棉隆结合生物防控和中生菌素处理中显著下调、在棉隆和生物防控处理中上调。由于亚硝酸盐还原酶和一氧化二氮还原酶参与了氮的反硝化过程[26]，而固氮蛋白和固氮酶参与氮的固定，这显示不同处理潜在的影响着土壤氮的转化和利用，棉隆消毒联合生物防控生姜产量增加明显，有可能是抑制氮的反硝化作用，而增强固氮作用，从而提高氮的利用率，最终导致产量显著增加。

土壤微生物是土壤生态的有机组分，在物质循环、植物生长等过程中扮演着关键作用。然而长期连作会破坏土壤团粒结构，导致土壤理化性质恶化、植物自毒物质积累、土壤微生物多样性丧失、病原菌积累，从而导致连作障碍的发生[27]。连作条件下，土壤微生物丰富度和均匀度均显著降低，通过人工干预改变土壤环境，如增施生物有机肥[28]、施用有益菌[29]等，能有效改善土壤微生态区系、减轻土传性病害的发生，在一定程度上抑制连作障碍。随着研究深入，研究者逐渐认识到土壤微生物组在控制土传性病害引起的作物连作障碍中的关键作用[30]，治理土传性病害引起的连作障碍必须恢复和重建土壤健康生态环境。尽管土壤消毒在短时间内造成土壤生物多样性的丧失，但大约在数周至数月内，土壤微生物区系自然恢复，同时土壤有害生物数量显著减少、有益菌显著增加，土壤微生物区系和群落结构并无显著改变[14-15]，显示土壤消毒有利于土壤微生组的修复与重建。在土壤消毒同时，增施生物有机肥或有益菌或许能更快的促进微生物区系恢复与重建。因此，结合本研究结果，实行棉隆土壤消毒与生物防控相结合的方法，防控高山生姜姜瘟病的发生具有较好的经济可行性和环境生态效应。本研究首次采用棉隆土壤消毒结合生物防控措施治理高山生姜姜瘟病连作障碍，防效和经济效益显著，同时发现，该措施有利于土壤微生态恢复和与重建，这为土壤微生态修复技术和理论发展提供了重要的支撑。

REFERENCES

[1] Zhang GM, Fan GQ, Zhu HC, et al. Study on the pathogen of the ginger wilt disease in Shandong[J]. Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science), 2001,32(4): 418-422 (in Chinese)张广民, 范国强, 朱汉城, 等. 山东姜瘟病病原菌的研究[J].山东农业大学学报: 自然科学版, 2001, 32(4): 418-422

,