鹅耳枥生态习性（专题报道鹅耳枥属物种叶绿体基因组结构及变异分析）

原创 赵儒楠等 南京林业大学学报

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鹅耳枥属物种叶绿体基因组结构及变异分析

赵儒楠1，褚晓洁2，刘 维1，何倩倩1，祝遵凌1*

１.南京林业大学风景园林学院，南京林业大学南方现代林业协同创新中心；2.浙江师范大学化学与生命科学学院。

叶绿体( chloroplast)是绿色植物进行光合作用的细胞器,具有可自主遗传的基因组,即叶绿体基因组( chloroplast genome)。绝大多数植物的叶绿体基因组是1个双链环状DNA,具有1个长单拷贝区(LSC)、1个短单拷贝区(SSC)以及2个反向重复区(IRa和IRb)4个区域。绝大多数高等植物叶绿体基因组的结构特征与基因组成相对保守,但因物种l间的杂交、物种进化以及基因渐渗等原因导致不同物种的叶绿体基因组结构会发生不同程度的变异。叶绿体基因组具有单亲遗传的特性,研究表明裸子植物的叶绿体基因组是父杀遗传,而大多数被子植物叶绿体基因组为母系遗传,还有一小部分被子植物叶绿体基因组为双亲遗传或父系遗传。叶绿体基因组包含着大量的DNA信息,其中很多基因是重要的DNA条形码，因此叶绿体基因被广泛用于物种分类、系统发育、物种起源以及避难所等研究中。

鹅耳枥属(Carpinus)是桦木科(Betulaceae)植物中进化最大的类群之一,目前全属包含约50个种,我国约有33个种,其中有27个为我国特有种,这些物种中还有一些是濒危的物种,例如普陀鹅耳枥(C. putoensis)等。目前仅有一小部分鹅耳枥属物种的叶绿体基因组被测序、组装。然而这些已被测序的物种中仅有普陀鹅耳枥、天台鹅耳枥(C. tientaiensis)、太鲁阁鹅耳枥(C. hebestroma)、宝华鹅耳枥(C. oblongifolia)以及疏花鹅耳枥(C. laxiflora)等少数几个物种的叶绿体基因组被研究,其他鹅耳枥属物种的叶绿体基因组特征以及鹅耳枥属物种叶绿体基因组在种间的变异情况,尚缺乏充分研究。由于鹅耳枥属物种间普遍存在杂交渐渗等现象,所以到目前为止鹅耳枥属的进化机制与物种间的系统发育关系尚未充分阐明。此外,叶绿体基因在植物物种形成与系统发育研究中扮演者重要角色,由于大多数叶绿体基因在不同属中存在不同程度的变异,因此研究适合用于不同属的物种界定与系统发育分析的叶绿体基因是十分必要的。因此通过对鹅耳枥属叶绿体基因组的结构特征及变异情况进行分析对今后鹅耳枥属物种系统发育及 DNA 条形码的选择具有重要意义。本期论文推荐的作者研究通过对鹅耳枥属 16个物种的叶绿体基 因组进行比较分析，以进一步了解鹅耳枥属物种叶绿体基因组成及结构特征，揭示 IR 区边界收缩与扩张，为进一步研究鹅耳枥属的系统发育关系、物种鉴定以及基因组进化研究奠定基础，同时为鹅耳枥属 DNA条形码的开发提供参考。

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作者简介

通讯作者

祝遵凌，男，1968年11月生，博士，南京林业大学教授，博士生导师，艺术设计学院院长。

第一作者

赵儒楠，男，1997年3月生，南京林业大学风景园林学院园林植物与观赏园艺专业硕士研究生。

关键词：鹅耳枥属；叶绿体基因组；变异；进化；系统发育

基金项目：国家林业和草原局林业科学技术推广项目(2019133119);江苏省“333工程”项目(BRA2018065);国家自然科学基金项目(31770752)。

引文格式：赵儒楠，褚晓洁，刘维,等.鹅耳枥属物种叶绿体基因组结构及变异分析[J].南京林业大学学报(自然科学版) ,2021,45(2);25-34.ZHAO R N,CHUXJ,LIU W, et al. Structure and variation analyses of chloroplast genomes in Carpinus[J].Jourmal of Nanjing Foresty University (Natural Sciences Edition),2021,45(2);25-34.DOI:10.12302/jisn.1000-2006.202009007.

1目的

了解鹅耳枥属(Carpinus)物种叶绿体基因组基因组成及结构特征,为鹅耳枥属的系统发育及基因组进化研究提供参考。

2方法

获取鹅耳枥属16个物种的叶绿体基因组,对其进行基因注释,利用生物信息学方法比较叶绿体基因组间的结构特征与变异程度,并以麻栎(Quercus aculissima)为外类群分析了鹅耳枥属的系统发育关系。

2.1 试验材料

于GenBank数据库(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank)中检索已发表叶绿体全基因组序列的鹅耳枥属物种信息,共检索到16个物种信息，下载其叶绿体基因组序列。检索到的16个物种名称、基因组登录号(表1)。

▼表 1 鹅耳枥属物种及其叶绿体基因组 GenBank 登录号

▲浙江天台山的天台鹅耳枥

▲河南老君山的千金榆

2.2 研究方法

本研究以天目铁木（Ostrya rehderiana ,GenBank登录号NC_028349.1)的叶绿体基因组作为参考,以在线工具GeSeq ( https:// chlorobox.mpimpgolm.mpg.de/ geseq.html)对16个鹅耳枥属物种的叶绿体基因组进行了基因注释。随后利用Geneious 10.2.2软件(https :// www.geneious.com/)统计叶绿体基因组各类型基因数目、GC含量以及LSC,SSC和2个IR区长度等信息。

为了直观展示鹅耳枥属叶绿体基因组基本特征,利用在线工具OGDRAW (https :// chlorobox.mpimpgolm.mpg.de/OGDraw.html)绘制鹅耳枥属叶绿体基因组结构图谱。在叶绿体基因组4个区连接位点差异分析中,利用IRscope ( https :// ir-scope.shinyapps.io/irapp/)可视化鹅耳枥属叶绿体基因组边界收缩扩张。在鹅耳枥属叶绿体基因组序列变异分析中,利用基因组在线分析程序mVISTA( http:// genome.lbl. gov/vista/index. sht-ml),以 Shuffle-LANGAN模式进行叶绿体全基因组比较。

3结果

鹅耳枥属16个物种的叶绿体基因组均为双链环形结构,均包含1个长单拷贝区(LSC),1个短单拷贝区(SSC)以及2个反向重复区(IRa和IRb)。叶绿体基因组大小差异较小,最大差异仅1902 bp。基因排列顺序基本一致,各基因数量相对保守,其中核糖体RNA(rRNA)数量最为保守,所有物种均为8个。此外,鹅耳枥属物种叶绿体基因组在序列长度、基因组成以及CC含量等方面相对保守,但4个边界存在明显的多样性。鹅耳枥属叶绿体基因组中非基因编码区存在较大差异,变异程度较高,而基因编码区差异较小,具有较高的保守性。在叶绿体基因组4个部分中, ISC区的变异程度最高, IRa区的变异程度最低。鹅耳枥属叶绿体基因组中photosystem ll protein Dl ( psbA ) ,ribosomal protein S 16( rps 16 ) ,ATP synthase CFl apha subunit ( atpA ) ,rps 19、NADH dehydrogenase subunit 5( nlhF ),ndhI以及hypothetical chloroplast open reading frame 1( yof1)等基因的编码区存在显著差异。此外,tRNA-His( trnH)-psbA ,photosystem ll protein Z( psbZ)-tRNA-Met( trnfM ),maturase K( maiK)-rps16,tRNA-Thr(trnT)-tRNA-Leu(trnL),tRNA-Phe(trnF)-ndhJ,atpB-ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit( rbcL)以及rpl32-trnL等基因间隔区的非编码区差异较大。绝大部分基因的编码区长度十分保守,含内含子的蛋白编码基因长度变异主要来源于内含子长度或编码区长度。系统发育分析结果将鹅耳枥属划分为鹅耳枥组与千金榆组,此外由于地理隔离导致欧洲鹅耳枥(C.betulus)、美洲鹅耳枥(C.caroliniana)与鹅耳枥属其他物种表现出较远的亲缘关系。

3.1 鹅耳枥属叶绿体基因组结构的基本特征

鹅耳枥属16个物种的叶绿体基因组图谱见图1。由图1以可知,鹅耳枥属16种植物的叶绿体全基因组均为双链环形结构,均具一个4分体结构，包含1个LSC、1个SSC、2个IR区,它们的叶绿体基因组大小为158 681~160 583 bp,其中欧洲鹅耳枥(C.betulus)最大,雷公鹅耳枥(C.viminea)最小，两者相差1902 bp。LSC区长度为87808~89 445bp, SSC区长度为17 184~18 872 bp,IR区长度为26 032~27568 bp。川黔千金榆(C. fangiana)、千金榆(C. cordata)、紫脉鹅耳枥(C. purpurinervis ) 、多脉鹅耳枥(C. polyneura)、云南鹅耳枥(C. monbeigiana)以及疏花鹅耳枥的IRa与 IRb长度完全相同,其余鹅耳枥属物种的IRa与IRb区长度仅相差1~3 bp。各物种GC含量为36.30%、36.40%或36.50%,差异较小。

▲图 1 鹅耳枥属植物叶绿体基因组图谱（部分）

鹅耳枥属16个物种叶绿体基因组比较结果见表2。由表2可以发现,鹅耳枥属16个物种的叶绿体基因组各基因数量相对保守,其中总基因数为122~126个,普陀鹅耳枥的总基因数最少,川黔千金榆的总基因数最多。核糖体RNA( rRNA)数量最为保守,所有物种均为8个。转运RNA( tRNA)数为29~31个,其中天台鹅耳枥、普陀鹅耳枥﹑紫脉鹅耳枥、岩生鹅耳枥(C. rupestris)、欧洲鹅耳枥和雷公鹅耳枥为29个，美洲鹅耳枥（C.caroliniana)和川黔千金榆的tRNA数为31个,其余各物种均为30个。蛋白编码基因数为85或86个,其中普陀鹅耳枥和太鲁阁鹅耳枥的蛋白编码基因为85个,其余各物种的蛋白编码基因均为86个。

▼表 2 鹅耳枥属 16个物种叶绿体基因组比较（部分）

3.2 鹅耳枥属叶绿体基因组 IR与SC边界

由于叶绿体基因组为环形结构,为具有1个LSC、1个SSC和2个IR区的4分体结构,所以叶绿体基因组存在 IRb-LSC、IRb-SSC、IRa-SSC以及IRa-LSC这4个边界。在叶绿体基因组进化过程中,其边界会发生扩张或收缩。鹅耳枥属叶绿体基因组在序列长度、基因组成以及GC含量等方面相对保守,但4个边界存在多样性(图2)。

鹅耳枥属16个物种的IRb-LSC边界均位于ribosomal protein S19 (rps19)和rpl2的基因间区或rps19的编码区。其中昌化鹅耳枥（C.tschonoskii)、川陕鹅耳枥(C. fargesiana）、美洲鹅耳枥、太鲁阁鹅耳枥、紫脉鹅耳枥、疏花鹅耳枥和宝华鹅耳枥的IRb-LSC边界位于rps 19的编码区,而岩生鹅耳枥、多脉鹅耳枥、云南鹅耳枥、雷公鹅耳枥、欧洲鹅耳枥、天台鹅耳枥、普陀鹅耳枥、川黔千金榆和千金榆的IRb-LSC边界位于rps 19和rpl 2的基因间区(图2)。

除美洲鹅耳枥外,鹅耳枥属绝大多数物种IRb-SSC边界与 NADH dehydrogenase subunit 5 ( ndhF)基因存在10~156 bp 的间隔，且 ndhF基因位于SSC区。美洲鹅耳枥ndhF基因缺失,其IRb-SSC边界与mitochondrially encoded tRNA isoleucine( trnl)基因存在152 bp的间隔。同时川黔千金榆的IRb-SSC边界位于hypothetical chloroplast open readingframe 1 (ycf 1)假基因上。而天台鹅耳枥和千金榆的ycf 1假基因完全位于IRb区内(图2)。

鹅耳枥属16个物种的IRa-SSC边界均位于ycf 1基因内, ycf 1基因在IRa区中的序列长度为1 163~2 740 bp,其中仅有欧洲鹅耳枥的ycf 1基因在IRa区中的序列长度为2 740 bp,其余均为1 163~1 192 bp。此外,鹅耳枥属16个物种的IRa-LSC边界具有较高的保守性,其边界均位于rpl 2

及tRNA一His( trnH)基因的基因间区(图2)。

▲图 2 鹅耳枥属物种叶绿体基因组的 4部分 IR区边界比较

3.3 鹅耳枥属叶绿体基因组序列变异分析

本研究利用mVISTA对鹅耳枥属叶绿体基因组序列比较结果进行可视化(图3),结果发现鹅耳枥属叶绿体基因组排列顺序基本一致,具有较高的保守性。鹅耳枥属叶绿体基因组非基因编码区存在较明显差异,变异程度较高。而基因编码区差异较小，具有较高的保守性。在叶绿体4个部分中,LSC区的变异程度最高,而IRa区的变异程度最低。

鹅耳枥属叶绿体基因组中photosystem ll protein D1 ( psbA ) 、rps16、ATP synthase CF 1 alphasubunit( atpA )、rps 19、ndhF、ndhI以及ycf 1等基因的编码区存在显著差异。此外，photosystem l assembly protein Ycf 3( ycf 3 )-tRNA-Ser(trnS) ,trnS-rps 4 、trnH-psb4、psbZ-tRNA-Met (trnfM)、maturase K(matK)-rps16、rps16 - tRNA-Gln(trnQ),trnQ-psbK ,cytochrome c biogenesis protein (ccsA ) -ndhD 、acetyl-CoA carboxylase beta subunit (accD)-photosystem l subunit Vll ( psal ) 、ndhC-tRNA-Val ( trnV)、tRNA -Thr ( trnT) - tRNA -Leu( trnL),tRNA-Phe( trnF)-ndhJ, atpB一ribulose-1 ,5- bisphosphatecarboxylase/ oxygenaselargesubunit( rbcL),trnT-psbD 、tRNA-Glu( trnE )一trnT、 tRNA一Asp( trnD)-tRNA-Tyr( trnY)、rpl32-trnL等基因间隔区的非编码区差异较大(图3)。

▲图 3 鹅耳枥属物种叶绿体基因组比对分析图

3.4 鹅耳枥属叶绿体基因组内含子分析

鹅耳枥属16个物种叶绿体基因组中内含子基因的编码区长度和基因全长见表3。由表3可见，鹅耳枥属16个物种的叶绿体基因组中总检测到11个含内含子的蛋白编码基因,包括rps16 、ATPsynthase CFO B subunit ( atpF)、RNA polymerase beta'subunit( rpoC1 )、yof 3 、ATP一 dependent Clp proteaseproteolytic subunit( clpP) .cytochrome b 6 (petB).cytochrome b6 /f complex subunit lV( petD ),rpl16、rpl2、ndhB和ndhA。在这11个含内含子的蛋白编码基因中,基因长度变异主要来源于内含子长度或编码区长度。绝大部分基因的编码区长度十分保守,其中petD和ndhB基因的内含子长度以及基因长度在16个物种间无任何变化。clpP基因的编码区长度在各物种间无任何变化,仅有内含子长度存在变异,在天台鹅耳枥和普陀鹅耳枥中发现petB基因缺失或内含子丢失。rpl2基因的全长在16个物种间无任何变化,但内含子长度存在改变。其余各基因在内含子长度或编码区长度均存在少量改变。

▼表 3 鹅耳枥属 16个物种叶绿体基因组中含内含子基因的编码区长度和基因全长

3.5 系统发育分析本研究以麻栎为外类群，将鹅耳枥属 16个物种叶绿体全基因组序列比对后，进行系统发育分析（图 4）。系统发育树将鹅耳枥属划分为千金榆组与鹅耳枥组，千金榆组最先从鹅耳枥属中分离出来，是鹅耳枥属的原始组。鹅耳枥组中欧洲鹅耳枥与美洲鹅耳枥由于地理隔离，与其他鹅耳枥属物种存在较远的亲缘关系。而其余鹅耳枥属物种可分 为 2支，雷公鹅耳枥、岩生鹅耳枥、天台鹅耳枥和普陀鹅耳枥为 1支；多脉鹅耳枥、川陕鹅耳枥、昌化鹅耳枥、云南鹅耳枥、疏花鹅耳枥、紫脉鹅耳枥、太鲁阁鹅耳枥以及宝华鹅耳枥为另 1支。

▲图 4 基于鹅耳枥属叶绿体基因组序列构建的系统发育树

4结论

鹅耳枥属物种叶绿体基因组具有较高的保守性,其基因排列顺序基本一致,未检测到大规模的倒位或基因重排,但其IR区与单拷贝区(SC)边界存在明显的多样性。基于叶绿体基因组构建的系统发育树在一定程度上可以揭示鹅耳枥属物种的系统发育关系。

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