提取细菌dna的方法：细菌DNA提取方法的优化

本文选用了大肠杆菌和水稻白叶枯病菌作为实验菌株，将培养一定时间的菌种所提取的dna，在紫外分光光度计下进行测定。实验首先研究超声时间对大肠杆菌dna提取效果的影响，其次在传统法、水煮法、es法（传统法 溶菌酶）、esu法（传统法 超声 溶菌酶）之间进行比较，分析不同提取方法提取的两种菌株dna的浓度及纯度，找出了一种准确、高效的dna提取方法，为今后生物检测鉴定工作提供了保障。

一、实验部分

（一）实验材料

大肠杆菌：革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×（1～3）μm。周身鞭毛，能运动，无芽胞，是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。

水稻白叶枯病菌：革兰氏阴性菌，由水稻黄单胞细菌水稻致病变种侵染引起的严重危害水稻生产的一种植物细菌。

（二）实验方法

1．细菌的培养。

根据两种细菌不同的生长条件制备相应的培养基，具体如下： 水稻白叶枯病菌：（na培养基）牛肉浸膏3g，蛋白胨7.5g，蔗糖10g，加蒸馏水至1000ml，调至ph7.0，121℃灭菌20min。固体培养基加1.5%琼脂。 大肠杆菌：（lb培养基）细菌培养用蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，加蒸馏水至1000ml，调至ph 7.0，121℃灭菌20min。固体培养基加1.5%琼脂。 大肠杆菌培养基放置于37℃的摇床上培养12h，水稻白叶枯病菌培养基放置于28℃的摇床上培养48h，由液体培养基的浑浊度来判断细菌的生长情况。

2．细菌dna的提取。

（1）传统提取法。 步骤一：取3ml过夜培养菌液于离心管中，离心1min，弃上清液，收集菌体； 步骤二：加800µl裂解缓冲液（40mm tris-醋酸，ph 7.8的20mm 醋酸钠，1mm edta，10% sds），吹打混匀（枪头去尖）； 步骤三：加400µl 5m nacl混匀后，离心12min（时间不能少）； 步骤四：将上清液移至另一离心管中，加入10 µl rnasea（10mg/ml）37℃温浴30min； 步骤五：加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25︰24︰1）抽提，充分混匀抽提； 步骤六：离心8 min收集上清，用氯仿抽提一次，离心8 min后吸取上清至新的离心管内； 步骤七：加2倍体积无水乙醇沉淀dna后离心8 min，用70％乙醇洗涤沉淀2次。 步骤八：干燥后，溶于100 µlte中于-20℃保存备用。

（2）水煮提取法。取过夜培养的菌液3 ml加入到离心管中离心1 min，弃上清；沉淀加入1.2 ml无菌去离子水，振荡混匀，100℃水浴10 min后离心5 min，上清即为dna溶液，-20℃保存备用。

（3）超声时间对dna提取效果的影响。在传统提取法步骤二后使用超声波（功率400 w）超声1、3、5和7 min，其他步骤同传统法。

（4）溶菌酶对细菌dna提取效果的影响。在传统提取法步骤一之后加入20µl50 mg/ml的溶菌酶，37℃温育30 min（不断振荡），其他步骤同传统法。

（5）超声、溶菌酶双重效应对dna提取效果的影响。在传统提取法步骤一之后加入20 µl 50 mg/ml溶菌酶，37℃温育30min（不断振荡），步骤二之后超声（功率400w）3 min，其他步骤同传统法。

3．dna浓度/纯度测定。

agilent 8453紫外分光光度计开机、开灯预热30min；用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入te缓冲液后，放入样品室的s池架上，关上盖板；设定狭缝后校零。将标准样品和待测样品适当稀释（dna15 µl用te缓冲液稀释至3000 µl）后，记录编号和稀释度。把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的s架上，关闭盖板；设定测定的紫外光波长，测定260nm、280nm波长时的od值及od260/od280的比值；计算待测样品的浓度（μg/µl）=od260×稀释倍数×50/1000。

二、结果分析与讨论

（一）超声时间对大肠杆菌dna提取效果的影响

实验采用经过12h恒温摇床培养的大肠杆菌作为实验菌种，利用传统提取法、传统法结合超声处理1min、3min、5min、7min的方法提取dna，每种方法所用大肠杆菌菌液量均为3ml，利用紫外分光光度计对提取的dna测定3次，结果取平均值，实验结果如图1、表1所示： 由表1可知，提取的dna浓度随着超声时间的延长而增大，这主要是因为超声使细菌细胞壁更容易破裂，从而裂解液中sds能更充分地破坏细胞膜及核膜的结构，使dna迅速释放出来。 在超声过程中发现，以超声3min破碎细菌提取的dna od260/od280最接近比值1.8，dna的纯度较高，超声波处理的时间不易过长，最佳破壁时间为3min。

（二）传统法与水煮法的比较

实验采用经过12h恒温摇床培养的大肠杆菌和48 h恒温摇床培养的水稻白叶枯病菌作为实验菌种，比较传统提取法与水煮法提取的dna浓度与纯度。所用菌液量均为3ml，利用紫外分光光度计对提取的dna测定3次，最后结果取平均值。实验结果如图2、表2、表3所示： 由表2、3可知，水煮法得到的dna浓度比传统法要高，主要因为水煮法步骤简洁，减少了操作过程中对dna的损失及外源dna污染机会。水煮法提取过程中不需要酚—氯仿抽提及乙醇沉淀，避免了对人体的危害，且所需费用低，但水煮法提取的dna纯度较传统法有小幅下降，主要是因为抽提过程简单，dna溶液中含有蛋白质等杂质无法完全去除。水煮法适用于对dna纯度要求不高的pcr、rapd等实验，因高温使dna变性，该法不适于限制性内切酶酶切分析。传统法所需费用低，但操作繁琐，耗时长，dna损失量大，产率低，且有污染和毒性作用。

（三）溶菌酶对dna提取效果的影响

图3 es法提取的两种菌种dna紫外吸收图谱 实验采用经过12 h恒温摇床培养的大肠杆菌和48 h恒温摇床培养的水稻白叶枯病菌作为实验菌种，比较传统提取法与es法提取的dna浓度与纯度。菌液量为3ml，用紫外分光光度计对提取的dna测定3次，结果取平均值，结果如图3、表4、表5所示： 由表4、表5可知，加入溶菌酶后提取的dna浓度有明显的提高，而纯度变化不是很大。es法在提取dna过程中，使用溶菌酶破壁后的菌液黏稠，不易脱蛋白，dna黏度大，纯度低，dna被蛋白质缠绕难以舒展变性，对变性过程中相对吸光度增长幅度略有阻碍。

（四）超声、溶菌酶双重效应对dna提取效果的影响

实验采用经过12 h恒温摇床培养的大肠杆菌和48 h恒温摇床培养的水稻白叶枯病菌作为实验菌种，比较传统提取法与esu法提取的dna浓度与纯度，所用菌液量为3 ml，利用紫外分光光度计对提取的dna测定3次，最后结果取平均值，实验结果如图4、表6、表7所示，传统法、es法紫外吸收图谱见图2、图3所示： 由表6、表7可知，esu提取的dna浓度及纯度较传统法、es法有很大的提高，效果十分明显。esu法在dna提取过程中，溶菌酶、sds和超声波三者联合作用使细菌破壁更充分，dna回收量大，纯度高，esu法在超声前加入溶菌酶，溶菌酶破壁后黏稠的菌液缓冲了单纯使用超声波对dna造成直接破坏，使提取的dna片段大小适中，浓度较高。

三、结论

1．dna浓度及纯度可以通过紫外分光光度计检测出来，速度快，准确度高，影响因素少。

2．dna浓度随着超声时间的延长而增加，而超声时间为3min的时候检测出来的dna纯度最好，所以超声最佳时间为3min。

3．溶菌酶的合理使用能增加提取dna的浓度。

4．esu法提取的dna无论是浓度还是纯度都比较理想，是一种值得推广的提取dna方法，主要针对于对dna浓度/纯度要求高的实验。

5．水煮法所需费用低，步骤简洁，耗时短，减少了dna损失及外源dna的污染机会，不需要酚－氯仿抽提及乙醇沉淀，避免了有机溶剂对人体的危害，但提取的dna浓度一般，纯度不高，适用于对dna纯度要求不高的pcr、rapd等实验。

四、结语

紫外分光光度法检测dna浓度、纯度是一种快速、有效的定量方法，可以根据待测物质在紫外区的吸收性质，来精确测定其dna浓度/纯度，为分子生物学的发展及dna相关的实验提供了方便。