菌种的传代与保存（常用菌种的传代与保存方法）

一、菌株概念及传代

（1）标准菌株：直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株。通常默认为第0代菌株。

（2）标准储备菌株：将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株。通常为第1代或第2代菌株。

（3）储备菌株：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。通常为第2代或第3代菌株。

（4）工作菌株：由标准储备菌株、 储备菌株或标准物质（经证明或未经证明） 转接一代获得的菌株。通常为第3-5代菌。

传代：每一次的转接培养都是一次传代的过程，可以使用液体、固体或半固体培养基。

注意事项：菌株传代只能由上往下传，储备菌株可以做为工作菌株使用，但工作菌株不能做为储备菌株使用。实验室使用的工作菌株一般不可超过第5代，除非标准方法中有明确要求，或实验室能够证明菌株相关特性没有改变。若在传代过程中出现明显变异，也不可继续使用。

二、菌种保存的基本原理

使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。干燥、低温和隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。有针对性地创造干燥、低温和隔绝空气的外界条件，就是微生物菌种保藏的基本技术。

三、菌种保存的常用方法 （1）斜面保存法 操作方法：将营养琼脂（或其他适宜的琼脂培养基）加热煮沸溶解后分装至试管中，灭菌后摆长斜面凝固，挑取菌落“之”字形划线接种至培养基斜面，置于合适的条件中进行培养。培养结束后，置2-8℃冷藏保存（部分菌株会在4℃产生自溶，如铜绿假单胞菌。副溶血性弧菌等，可置室温保存）。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，操作简单，使用方便，但易变异，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。霉菌、酵母菌、放线菌和芽孢菌一般保存2-4个月传代一次，细菌一般保存一个月传代一次。

斜面保存法

（2）液体石蜡保存法 操作方法：将营养琼脂（或其他适宜的琼脂培养基）加热煮沸溶解，分装至试管中灭菌后摆长斜面，或使用半固体培养基加热煮沸溶解后分装至小试管，灭菌后摆直立，挑取菌落“之”字形划线接种至培养基斜面或穿刺接种至半固体培养基管，置于合适的条件中进行培养。培养结束后，在培养基表面覆盖一层无菌液体石蜡，2-8℃冷藏保存。 液体石蜡一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。此法比斜面保存法的保存期限更长，霉菌、酵母菌、放线菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更长时间，多数无芽孢菌也可保存到一年以上。（3）甘油冻存保存法 操作方法：挑取菌落至液体菌种保存管中（商品化的液体菌种保存管中已加入甘油，直接使用即可；若自行配制，可在冻存液中加入15%-50%比例的甘油，或将菌液与无菌甘油溶液混合），用移液枪吹打均匀，制成约109CFU/mL的菌悬液，置于超低温冰箱中或液氮罐中冷冻保存（霉菌可挑取孢子冻存，保存温度越低效果越好，长期保存建议在-70℃以下冻存）。 该方法适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。-20℃保存时间较短，一般可保存一年左右，-70℃以下可保存较长时间，一般至少可保存两年以上，有些菌种甚至可保存十年以上。注意事项：反复冻融易导致菌株死亡，在中国药典中规定，融化后的菌种保存管不可再进行冷冻保存。

液体菌种保存管（含甘油）

（4）真空冷冻干燥保存法 通常以牛奶为载体，加入菌株制成菌悬液，使用真空冻干机器进行脱水冻干处理，制成冻干粉。相比较于其他保存方法，真空冷冻保存法更容易保存菌种的活力，延长保存时间，适用于98%以上菌种的保存，但操作复杂，一般实验室难以使用。 （5）载体保存法 以沙土、滤纸、硅胶等材料做为载体吸附菌株，通过五氧化二磷干燥保藏的方法。保藏时间长，应用较为广泛，但一般实验室通常不易操作。 （6）瓷珠保存法 瓷珠菌种保存管是实验室保存菌种的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存，甘油做为抗冻保护剂可减少冷冻过程中形成的冰晶，瓷珠菌种保存管放置于-20℃或-80℃下便可创造干燥、低温、缺营养的环境，使菌株处于“休眠” 状态，方可长期保存（视不同菌种与保存温度，一般可保存3-10 年），同时菌种保存管的取用和保存较为便利（取用复苏及保存菌株仅需1 分钟）。 保存方法：挑取平板或斜面上的新鲜纯培养物于菌种保存管中，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液，盖上盖子来回颠倒几次使细菌乳化，用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，仅留下瓷珠，拧紧保存管，迅速将其置于-20℃或-70℃冰箱中。 使用方法：无菌条件下，用灭过菌的针或者镊子取出一个小瓷珠，将小瓷珠直接用作平板划线或加到合适的液体培养基中，置合适的条件下进行培养即可。

瓷珠菌种保存管

四、实验室常用菌种的保存方法

（1）短期、中期保存：葡萄球菌、沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、假单胞菌、李斯特氏菌等，可使用营养琼脂斜面或TSA斜面4℃保存（铜绿假单胞菌在4℃会出现自溶，可以置室温保存），通常可保存1-3个月。白色念珠菌、酵母菌、霉菌等可使用沙氏葡萄糖琼脂斜面4℃保存，通常可保存3-6个月。生孢梭菌、产气荚膜梭菌可使用疱肉培养基培养后置4℃保存，可存活数月至1年以上。 （2）长期保存：对于大多数的细菌、真菌，普通实验室都可以选用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下冻存，温度越低保存时间越长。（注：保存霉菌时挑取孢子冻存即可；保存厌氧菌建议使用甘油保存法，避免反复冻融；使用甘油冻存法保存弯曲杆菌、螺杆菌、嗜血杆菌等细菌时，加入5%-10%比例的脱纤维羊血效果更佳）。

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