小鼠骨关节炎模型制备（实验动物模型平台）

作者科研体会：文章作者所在课题组曾在该实验实施前做过一次预实验，发现1周的造模周期确实会使模型动物膝关节炎症表象明显，但在后期观察中发现，其关节积液会随着时间减少，炎症因子检测较之前降低，与上述研究结果一致。但在造模过程中，在第12天再次对模型兔进行药物注射后，可以表现出较为稳定的、贴合临床的膝骨关节炎滑膜炎模型。研究发现，滑膜受损后易于修复，且可过度增生，同时膝骨关节炎滑膜炎是一种慢性疾病，结合前人研究和实验，可以合理认为膝骨关节炎滑膜炎的总体病理过程应该是由于膝关节在长期损伤和修复过程中形成的退化性疾病。因此，作者认为稳定的膝骨关节炎滑膜炎模型相应会有一个损伤-修复-再损伤的发病过程。

材料

1 动物管理 6月龄健康雄性清洁级新西兰大白兔16只，平均体质量2.0-3.0 kg，购自上海市松江区车墩实验动物良种场，许可证号：SCXK(沪)2017-0003。所有实验动物均按照12 h昼夜节律饲养，自由饮食。

2 试剂及仪器 木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)；L-半胱氨酸(北京索莱宝科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛 (合肥兰杰柯科技有限公司)；苏木精染液/伊红染液(无锡江原失业技贸总公司)；肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、前列腺素E2 ELISA试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)；离心机(TGL-168，上海安亭科学仪器厂)；数字皮温器(LG-507，蓝格科技有限公司)。

实验方法

1 分组 动物适应性饲养(温度20-25 ℃，湿度65%)1周后，采用随机数字表法，将16只兔分为对照组和模型组，每组8只。

2 模型制备 造模方案基于以往相关研究并结合作者所在课题组预实验制定，采用4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液制备膝骨关节炎滑膜炎兔模型，而对照组不进行任何干预。该方案具体步骤如下：①用10 mL注射器抽取6 mL木瓜蛋白酶溶液和3 mL半胱氨酸溶液，配制成4%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液(2∶1)，摇匀后注入10 mL离心管，水浴加热至常温。②将模型组兔抓取至兔固定器中，称质量记录后，剃去兔右膝关节长毛，并用碘伏进行消毒。用1 mL注射器抽取0.2 mL/kg混合试剂，将兔膝关节屈曲45°，沿髌间窝方向对髌骨下缘髌韧带外侧进针，进针后手下有落空感即可，撤回1 mm后回抽，如无血液倒流则可注入试剂。

以上操作从造模第1天开始执行，分别于造模第1，4，7，12天进行相同操作，给药时间共计14 d。在模型制备过程中，模型组有1只实验兔发生死亡，剩余动物进行模型评价，其中模型组7只，对照组8只。

3 肤温测试 记录实验开始前、实验第2，5，8，13，15天早9：00对各组兔膝关节进行膝关节肤温测量。安抚实验兔使其保持安静，将数字皮温器测温头置于兔膝关节髌骨处，待温度不再变化后记录读数为兔膝关节肤温。

4 膝关节MRI 实验第14天从每组随机选取2只动物，用10%的水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射以达到深度麻醉效果，将兔双下肢伸直并用纱布绷带绑定，兔尾用医用胶布向背固定，充分暴露双膝关节后仰卧位行MR检查。扫描序列：T1WI(TR：11.70 ms，TE：5.17 ms，TA：4:37，voxel size 0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm，Rel.SNR 1.00，Dist factor 20%，Fov read 100 mm，Slice thickness 0.58 mm， phase oversampling 80%，Slice oversampling 57.1%，Slices per slab 56，Averages 2，Concatenations 1，Coil elements 15K)、T2WI(TR：15.50 ms，TE：5.10 ms，TA：4:33，voxel size 0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm，Rel.SNR 1.00，Dist factor 20%，Fov read 100 mm，Slice thickness 0.6 mm，phase oversampling 70%，Slice oversampling 6.7%，Slices per slab 60，Averages 2，Concatenations 1，Coil elements 15K)。观察关节积液及软骨情况，由专业影像学技术人员对MRI图像进行解析。

5 麻醉与取材 实验第15天用10%水合氯醛按3.5 mL/kg对实验兔进行腹腔麻醉后(建议先给总量的2/3，观察兔的反应再给剩余量)。抽取兔右膝关节滑液，观察关节液的颜色、黏稠度等大体情况，然后将关节液放入冷冻管中，-80 ℃保存。剪断股四头肌腱，沿髌骨内外两侧纵行剪开关节囊，将髌骨及髌韧带向下翻，观察髌上囊及脂肪垫上的滑膜色泽。眼科剪紧贴脂肪层剪下滑膜，PBS洗净，放入40 g/L多聚甲醛中，在4 ℃环境下保存。

6 苏木精-伊红染色观察 将兔膝关节滑膜组织放入包埋盒中，进行PBS冲洗、常规梯度乙醇脱水、透明，随后将组织放入熔化的石蜡中进行浸蜡和包埋，5 μm厚连续切片。将切片分别作苏木精-伊红染色后，用普通光学显微镜观察。

7 ELISA 取出试剂盒，严格按照说明书方法进行加样、加酶标溶液、温育、洗板、显色操作，在450 nm波长下读取酶标板各孔的吸光度值，同时用软件Ascent software for Multiskan对吸光度值进行分析，计算出滑液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、前列腺素E2的质量浓度。

1.5 主要观察指标 ①兔膝关节表面观察；②形态学观察：影像学、组织学；③分子水平：肿瘤坏死因子α、白细胞介素β、前列腺素E2。

1.6 统计学分析 应用SPSS 23.0软件处理数据，所有计量资料以x±s表示，并对所有计量资料进行正态性检验及方差齐性检验。符合正态检验的组间比较采用独立样本t检验，非正态分布组间比较采用Mann-Whitney U检验。此次研究中，所有结果均采用独立样本t检验进行统计，P < 0.05表示差异有显著性意义。

信息来源：中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3738-3743.