单细胞测序设计思路与数据分析（单细胞测序的分析利器）

自从2009年第一篇单细胞RNA（single cell RNA-sequencing, scRNA）的文章发表以后，随着测序成本的降低、技术的成熟，越来越多的科研工作者开始将单细胞RNA测序引入到自己的科研工作中，希望发表CNS级别的文章，走上人生巅峰！

然而，一个现实的问题是，目前开发了大量的针对单细胞RNA测序的算法工具，特别是2016年以后，新的工具更是层出不穷（图1）。因此，系统的总结这些工具，从而使科研工作者能比较方便的检索、了解和选择这些工具，更加专注于科学问题的解决，就显得十分的重要了。

图1，开发的单细胞RNA数据分析工具数量随时间的变化

今天我们就来为大家介绍一个这样的数据库scRNA-tools（www.scRNA-tools.org ，图2）,它非常系统全面的收集了当前scRNA分析的主要工具，并根据工具的主要功能进行了分类，同时，提供了工具相关的文献Doi号，方便大家学习和使用。

图2，scRNA-tools的首页（有Table， Tools， Categories， Analysis ，Updates， Submit和FAQs等选项）

01、数据处理流程

在对scRNA-tools数据库收集的工具进行介绍之前，我们先简单了解一下scRNA数据分析的4个主要流程：

Phase 1：Data acquisition

数据获取，即是从下机的reads到表达矩阵的构建。主要涉及将reads比对到参考基因组，并完成定量；对于采用Unique Molecular Identifiers (UMIs)这种测序模式的，则需要去重以完成表达量的绝对定量。

Phase2：Data Cleaning

数据清洗。主要是去除低质量的细胞和无意义的基因，从而得到可用于下游分析的高质量的数据集。往往还会涉及到数据的归一化和缺失值的填补。

Phase3：Cell Assignment

细胞的分类。主要是采用降维和聚类算法将基因表达模式相似的细胞聚为一类，每一类的细胞可能是已经发现的细胞类型，也可能是未发现的新的细胞类型。也包括根据基因表达特征模拟细胞发育轨迹。

Phase4：Gene Identification

标签基因的鉴定。根据基因分类或者轨迹构建结果发现相关的特异性基因，如差异表达的基因。

从上述流程可以看出，scRNA分析中使用的主要工具有比对、QC、降维、聚类、轨迹分析等，数据库共将之分为32类，下面将具体介绍。

02、scRNA-tools之工具介绍

数据库将每个工具赋予2个身份标签，分别为Phase和Categories。具体信息如表1：

可以看出，除了上面列出的4个phase以外，还要一些other项，主要包括下游一些个性化分析，或者有的工具功能较多，如包括多个phase等。

对不同种类的工具的数据进行统计，我们可以发现，比较多种类的为可视化、聚类、排序、降维、归一化、差异分析和质控等，这些分析或是scRNA分析的上游步骤，或是scRNA必须要回答的科学问题，其余种类的工具则比较专业化或个性化，因此开发的工具也相对较少。（见下图）

此外，对于各个工具采用的计算机语言统计发现（下图），R语言占有绝对优势（约60%），其次为Python语言。因此，好好学习R吧，如果可能，也请学Python；毕竟，它们是数据分析领域的绝代双骄！

03、结语

scRNA-tools比较系统全面的收集和总结了当前scRNA领域的信息分析工具，涉及的领域较大，工具数量庞大（共275个）。因此，作为使用者，我们需在大致了解的前提下，专注于使用量多、引用率高的工具，这样才会使文章的分析比较有说服力，也更能获得同行的肯定和认可！

参考文献

1 Zappia, L., Phipson, B. & Oshlack, A. Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database. PLoS computational biology 14, e1006245, doi:10.1371/journal.pcbi.1006245 (2018).

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