园艺植物基因克隆怎么做（新的植物基因编辑方法无需组织培养）

2019年12月16日，Nature Biotechnology杂志在线发表了来自美国明尼苏达大学Daniel F. Voytas课题组题为“Plant gene editing through de novo induction of meristems”的研究论文。该研究报道两种通过从头诱导分生组织产生植物基因编辑的方法，并能获得稳定遗传植物。该方法避免了组织培养的需要，并有望克服植物基因编辑的瓶颈。

此外，介于该文的重要性，Nature Biotechnology杂志在线刊发了评论文章“Fast-track for engineered plants”的研究论文。该文认为该研究证明了无需组织培养也可以产生转基因和基因编辑的植物。

在气候变化和人口增长的情况下，借助植物生物工程可能会产生高产和抗逆的作物。然而，与哺乳动物细胞不同，植物细胞具有细胞壁，构成了外源生物大分子递送的主要屏障。常规植物生物大分子投递方法中，农杆菌介导和基因枪是最成熟和最受欢迎的两种工具。但是这些方法需要植物组织培养生成愈伤组织，或只能针对狭窄范围的植物物种。迄今为止，植物遗传转化缺乏一种能允许递送不同的生物分子进入所有植物组织和物种，而不需要借助外力并且不引起组织损伤。为此，寻找一种能通过细胞壁或者不需要组织培养的转化方法成为植物转基因及基因编辑的主要研究方向！

今年以来，一系列的文章报道碳纳米管和纳米片及DNA纳米结构通过表面接枝或封装策略将DNA和RNA生物大分子能通过植物细胞壁递送植物细胞内，从而避免使用外力和组织损伤，这是植物遗传转化中重要的进展！（详细点击任何植物都能进行转基因/基因编辑的方法被开发？来自两篇Nature Nanotech文章报道纳米颗粒！！；【PNAS】再一次突破！DNA纳米结构递送生物大分子到植物细胞内！继碳纳米管后又一重要进展！；【Nature Protocols】前沿！教你如何用纳米管进行植物转基因！）。这些研究确定了利用碳纳米管或DNA纳米结构可将生物大分子递送到植物细胞内的可行性。同时，2019年10月20日，预印本BioRxiv在线发表了来自英国布里斯托大学的Heather M. Whitney课题组在布了题为“A simple method for spray-on gene editing in planta”的研究论文。该研究实现了通过叶面喷洒Cas9和gRNA质粒-纳米复合体，成功实现了对小麦SPO11基因中进行基因编辑（点击查看）。综上所述，以上报道证实了利用纳米材料为载体进行无组织培养的转基因及植物基因编辑在某种程度上是可行的。然而，如何将转基因或基因编辑能稳定遗传到下一代仍然是需要解决的问题。

该研究利用植物体细胞具有全能型，通过在体细胞中特定DR（ developmental regulators 如WUS，STM，MP等）组合的异位表达具有诱导分生组织的潜力的原理，将DR和基因编辑体系同时表达，通过从头分生组织诱导产生转基因和基因编辑的芽，最终传递给下一代形成稳定遗传。

该研究报道了两种方法，第一种称为Fast-TrACC (fast-treated agrobacterium coculture)的方法。该方法首先将烟草进行无菌培养，然后用农杆菌将玉米中的Wus2基因和拟南芥STM基因以及荧光素酶报道分子递送至本氏烟草细胞中，之后切下转基因的芽并在培养基中培养以再生根和整个植物，并从获得稳定遗传材料，发现后代植物中有荧光表达，说明了该方法可用于转基因。尽管仍然需要生根培养基，但该方法绕过了通常需要产生芽的大部分耗时的组织培养步骤。

此外，该研究还应用Fast-TrACC来生成基因编辑的植物。将携带DR和靶向两个八氢番茄红素去饱和酶（PDS）同源物的sgRNA用农杆菌转化到组成型表达Cas9的烟草中。研究结果显示，产生了带有两个PDS同源物基因敲除的不育白色植物，以及在单个PDS等位基因中进行编辑并产生种子和可遗传编辑的绿色植物，说明了该方法可以实现植物内源基因的编辑，并能获得稳定遗传（ 如下图所示）。

第二种方法改进了第一种方法，可以直接用于土壤中生长的烟草，从而无需无菌条件。该方法直接用农杆菌携带DR组合基因的表达侵染烟草植物的切梢，同时转化荧光素酶标记基因或靶向两个PDS同源物的sgRNA的不同组合。如第一种方法观察到的，荧光素酶能在新生的芽顶点表达，同时还获得了在两个PDS同源物中携带可遗传基因编辑的烟草。

因此，该研究创建了Fast-TrACC新方法，无需组织培养就可以产生转基因和基因编辑的植物。同时，我们公众号iPlants也认为该方法的限制所在，第一，Fast-TrACC基因组编辑需要在亲本植物中需要Cas9表达。 不过这个可以通过将Cas9蛋白一起随同sgRNA共同转化可以解决。第二，利用农杆菌侵染，具有寄主限制，同时该限制也可以通过其他传递方法，如我们前面所提到的纳米粒子替代农杆菌。因此，将这些方法综合起来，使植物基因编辑可以在广泛的物种得到应用，从而快速生产转基因和基因编辑的种质，加速商业化植物品种的开发！

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0337-2

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0371-0