蛋白质组学常用研究手段及原理（空间蛋白质组学完整解决方案）

空间蛋白质组学是连接单细胞组学、空间转录组和空间功能表型之间的桥梁。蛋白是所有细胞的功能性分子，并且是所有生物过程的效应产物。通过单细胞及空间转录组得到的一些BioMarker，最终都需要在蛋白质层面上进行验证。Akoya推出的基于荧光成像的空间蛋白质组学技术使得研究人员能够以单细胞分辨率对整个组织切片中多达100种蛋白标记的空间表达进行量化，从而深入解析组织微环境，为组织生物标记物开发，肿瘤创新药物靶点发现及临床病理免疫诊疗提供强大的技术手段。

云准科技作为Akoya在中国的空间生物学实验基地，可以为您提供完整的空间蛋白质组学解决方案，并实现单细胞及空间多组学的整合分析。

云准科技拥有完整的空间蛋白质组学研究平台

——为您提供从探索发现、医学转化到临床研究的连续解决方案

PhenoCycler-Fusion

单细胞原位空间组学分析平台

• 可在单张切片上同时检测多达100种以上的蛋白质标志物

• 利用高参数实现生物标志物的发现，深入洞察空间表型

PhenoImager HT

高通量自动定量空间表型分析平台

• 可在单张切片上同时检测多达9色荧光复染信息

• 快速进行生物标志物的验证，理解和预测预后反应

空间蛋白质组学服务内容

超多色单细胞空间原位分析

云准科技采用Akoya商业化的肿瘤免疫Panel—STEP (Spatial Tissue Exploration Program)Kit配合Akoya的单细胞原位空间组学分析系统（PhenoCycler-Fusion），实现20 Marker的检测可以助力科学家精准研究肿瘤免疫微环境，分析组织内部细胞类型及占比以及细胞间的相互作用，解析肿瘤免疫功能机制，为治疗和预后提供参考依据。

超多色单细胞空间原位检测技术原理

PhenoCycler-Fusion可以实现超多色成像的核心技术原理是每种抗体上标记特异性寡核苷酸条形码标签(Barcode), 荧光上也会带一段特异性的寡核苷酸序列。抗体和荧光染料通过特异性的Barcode序列相互识别。带有不同特异性Barcode的几十种抗体在混合后，同时与组织进行孵育。抗体在组织切片上充分结合了各自对应的抗原靶标，然后将组织切片放入PhenoCycler-Fusion仪器当中，进行自动化染色，每次加3种荧光，荧光上的寡核苷酸序列可以和抗体上的Barcode特异性识别，然后进行成像，洗脱荧光，接着再进行下一轮染色，成像，洗脱，循环往复。这样就可以突破可见光谱荧光成像通道数量的限制，轻松实现几十种甚至100 种蛋白指标的同时检测及分析。

肿瘤免疫Panel抗体列表

※对不同组织类型及应用领域（如：肿瘤，免疫，神经，发育，传染病，干细胞，器官移植等）定制个性化的Panel

分析内容

数据展示

1.单细胞分辨率的超多标图像，可任意组合并显示需要观察的蛋白

图注：对人的扁桃体组织FFPE切片进行STEP panel检测

2.单细胞划分及蛋白质组原始矩阵数据

图注：根据细胞核染色将每一个细胞单独的划分出来，并给出每一个细胞完整的蛋白质组表达水平、空间位置信息、细胞形态信息等数据

3.细胞表型注释

图注：根据不同细胞的蛋白质表达差异将其注释为不同的细胞表型，并可统计该类型细胞的数量，高表达的蛋白质等信息

4.细胞表型原位标记（Voronoi视图）

图注：依据定义出的不同细胞表型，将所有划分出的细胞在图像上直接进行原位注释，并用字母标识出细胞类型，可以直接观察不同类型细胞的分布状况

图注：人源FFPE扁桃体样本细胞表型原位标记

5.细胞相关性/交互性分析

图注：在全片上任意选择区域，可分析该区域中不同细胞之间的相关性，以热图形式导出，用以探索不同细胞间的交互性

图注：直接导出可视化的细胞交互性数据，指示不同细胞类群之间的关联性强弱

6.t-SNE聚类分析

图注：根据蛋白表达水平的差异，将细胞分为不同的类群，导出蛋白质组的tSNE降维数据

图注：单细胞级别的数据可支持客户发现一些占比很低的稀有细胞类群，此外还支持将数据中的每个细胞或细胞类群回溯到组织原位上去，从而获得多组学的数据信息

7.多组学数据联合分析

图注：通过生信分析算法，将单细胞测序得到的蛋白-转录组数据和PhenoCycler得到的蛋白-空间数据进行映射，从而得到单细胞级别的空间信息-转录组信息-蛋白表达信息的多组学数据，进行进一步的联合分析

送样要求

样本类型：组织石蜡切片（FFPE）、组织冰冻切片（FF）、细胞涂片；

样本形态：组织大片、组织芯片（TMA）、穿刺样本；

样本要求：切片厚度为4 μm（冰冻切片厚度10 μm），最少应包含3000-5000细胞，面积最大不超过15 mmx35 mm；

样本量：根据抗体Panel的不同及个性化程度提供。

3-9色高通量免疫荧光定量分析

云准科技依托Akoya的高通量自动定量空间表型分析仪（PhenoImager HT）,可以根据不同癌种及组织类型进行Panel定制，利用前人的研究成果，选取感兴趣的Biomarker，实现3-9色的高通量免疫荧光定量分析，进行组织微环境的研究。也可以对单细胞及空间多组学得到的Marker基因进行验证。

3-9色高通量免疫荧光定量技术原理

PhenoImager HT之所以能够实现多达9色的成像，其核心技术原理是TSA信号放大技术和多光谱信号拆分技术。

每轮染色中在样本上依次孵育一抗、二抗及Opal荧光染料，荧光染料在偶联于二抗上的辣根过氧化物酶（HRP）的催化下会发生信号放大效应，荧光信号沉积在目标蛋白位置并与其稳定结合，随后通过微波洗脱将一抗二抗去除，从而达到荧光直接标记于目标蛋白的效果。接着再进行下一种蛋白的标记，以此类推，最多可以在单张样本上标记8种蛋白，最后进行细胞核DAPI染色，实现9色复染。

染好色的玻片进行PhenoImager HT上机，对组织切片进行扫描成像，通过多光谱拆分技术进行信号的还原，确保9色信号不串扰。

服务流程

① 送样要求

1. 组织应当用10% 中性福尔马林固定，正常固定时间为 18 ～ 24 小时；

2. 样本为石蜡切片或冰冻切片；

3. 使用防脱载玻片；

4. 石蜡切片厚度为4μm 左右，冰冻为10μm 以下；

5. 样本应置于玻片正面、中央；

6. 组织无褶皱、破损、刮伤、污渍；

7. 避免坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品。

② 方案设计&样本制备

云准实验室提供定制化的组织多色标记服务，针对冰冻及石蜡组织样本，根据客户的研究需求灵活搭配抗体panel，助力肿瘤免疫学研究。

③ 报告确认优化实验

④ 设计分析参数 | 数字化定量批量分析

超多色单细胞空间原位免疫荧光分析

应用案例分享

题目：Coordinated Cellular Neighborhoods Orchestrate Antitumoral Immunity at the Colorectal Cancer Invasive Front

时间：2020年9月

期刊：Cell(IF: 66.85)

单位：斯坦福大学

本研究利用Akoya的PhenoCycler-Fusion超多色单细胞空间原位免疫荧光分析，对来自35名结直肠癌患者的140个组织样本中的56个标志物进行超多重组织成像，揭示肿瘤微环境存在的不同细胞类型并根据细胞分布划分细胞邻域；然后根据细胞邻域的空间分布差异区分低风险和高风险患者；结合临床预后结果验证与高危患者的存活率密切相关的PD-1 CD4 T细胞亚群等。

PhenoCycler-Fusion工作流程和超多重免疫荧光成像结果

根据免疫微环境中细胞分布情况划分9种不同的细胞邻域，

根据细胞邻域分布的差异区分患者疾病类型

单细胞转录组测序 7色免疫荧光检测

应用案例分享

题目：Defining HPV-specific B cell responses in patients with head and neck cancer

时间：2020年7月

期刊：Nature(IF: 69.504)

单位：埃默里大学

本研究对HPV阳性的头颈鳞状细胞癌的肿瘤微环境中的体液免疫进行研究，利用10x Genomics单细胞转录组测序分析8271个B细胞样本，发现肿瘤微环境中存在HPV特异性激活的B细胞、抗体分泌细胞和生发中心B细胞，即存在HPV特异性B细胞反应；然后利用Akoya的PhenoImager多重免疫荧光技术验证单细胞测序结果，通过多靶标共定位分析鉴定不同的B细胞亚群（CD19 CD20 B细胞、CD19 CD20 Ki67 活化B细胞、CD19 CD20-IRF4 浆细胞）。且HPV特异性B细胞反应倾向于发生在肿瘤间质而不是肿瘤实质内。该发现有助于加深我们对人类肿瘤微环境中体液免疫的理解，同时提示肿瘤浸润的B细胞或可用于开发治疗药物。

单细胞测序发现肿瘤微环境中存在多种B细胞亚群

多靶标共定位验证肿瘤微环境中存在的不同B细胞亚群

单细胞和空间转录组测序 超多色单细胞

空间原位免疫荧光分析 应用案例分享

题目：An N-Cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery, chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer

时间：2021年12月

期刊：Nature Communications(IF: 17.794)

单位：西达赛奈医学中心

本研究利用10x Genomics单细胞转录组测序定义膀胱癌肿瘤微环境上皮细胞亚群（CDH12 细胞等）；接着通过10x Genomics Visium空间转录组数据表明上皮细胞CDH12表达和T细胞相关基因表达具有高度空间关联性；然后利用Akoya的PhenoCycler-Fusion单细胞分辨率空间蛋白质组学验证空间转录组结果，进一步表明CDH12 上皮细胞和免疫细胞尤其是T细胞存在显著的共定位。多组学技术手段验证了CDH12 上皮细胞具有膀胱癌免疫治疗反应效果预测功能。

10x单核转录组测序发现肿瘤样本中存在的不同细胞亚群

空间转录组和空间蛋白质组联用验证CDH12 上皮细胞

优先与表达 CD49a、PD-1和 LAG3 的 T 细胞共定位

云准科技一直致力于为客户提供完整的单细胞及空间多组学解决方案，目前公司分别在上海和广州配置了标准的的单细胞及空间多组学实验室，拥有专业的实验操作团队和强大的生信分析团队。目前公司已经完成了5000 例样品,涵盖人，鼠以及各种其他动植物，水产类物种的各种组织类型，积累了丰富的项目经验，和全国各大高校，科研机构，医院建立了良好的合作关系。我们一直秉承着追求卓越，敢为人先的创新精神，同我们的客户一道，为探索生命奥秘竭尽全力。

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云准医药科技（上海）有限公司（以下简称：云准）英文名：AccuraMed，用精准和医药相结合。云准成立于2016年，是一家专注于组织生物学标记物检测分析、肿瘤创新药物靶点发现及临床病理免疫诊疗检测方案开发的高科技公司。针对当前热点的肿瘤免疫相关研究致力于为客户提供先进的肿瘤组织免疫微环境分析解决方案。目前我们公司代理Akoya的产品（PhenoCycler平台和PhenoImager平台），并基于此可以提供肿瘤免疫微环境检测相关技术服务。此外云准科技还可以为您提供单细胞 空间多组学技术服务，全方位解析生命的奥秘。云准科技拥有显微切割平台及Thunder活细胞成像平台，为您提供专业的显微切割和Thunder活细胞成像服务。此外我们公司还有配备了3i显微镜成像系统，可以为您提供Marianas LightSheet 成像技术服务和Cleared Tissue LightSheet组织透明化成像服务。此外我们还引进了Agena核酸质谱进行基因分型的检测服务。未来，云准将以创新为驱动力，继续对产品进行深度整合与开发，推动肿瘤免疫、创新免疫疗法和病理诊断技术的突破性发展，必将为肿瘤的诊断和治疗带来革命性变化。

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