滁州光催化活性炭吸附一体机：ACSCatalysis醛生物催化氘化平台的合理设计

今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Rational Design of Biocatalytic Deuteration Platform of Aldehydes”，通讯作者为浙江大学化学系前沿技术化学中心的吴起教授。

C-H键与C-D键的区域选择性取代已成为化学和化学生物学中的重要工具，并经常用于机理研究、代谢组学以及NMR和MS分析。在药物化学中，将氘原子掺入活性药物成分可以显着增强候选药物的代谢和药代动力学特性，因为C-D键比C-H键更强。2017年，第一个氘代药物Austedo获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，这一里程碑极大地推动了合成方法的发展，有效地生成氘代building blocks。

芳香醛被广泛用于合成小分子药物、农用化学品和天然产物的构件。由于它们的普遍性，长期以来一直在寻求开发用于氘化醛的高效方法以增加含氘先导化合物的可用性。传统的醛氘化方法依赖于醛前体（如酯、酰胺和卤化物）的还原和/或氧化（方案1A）。相反，氢同位素交换 (HIE) 是一种更有效和原子经济的途径，无需前体制备，只需一步即可将氘掺入化合物中。此前，一些研究报道的 HIE方法已用于高效合成氘醛，但这些方法需要昂贵的金属催化剂、无氧反应条件或精心合成的 N-杂环碳烯 (NHC)（方案 1B）。因此，鉴于氘代醛在众多应用中的潜在效用，仍然迫切需要多样化的实用高效HIE方法。

与化学合成催化剂相比，酶已成为传统有机合成的有力替代品，因为它们高效、选择性好、环境友好。然而在大多数情况下，酶具有催化特异性，这限制了它们在有机合成中的应用。随着对酶作用机制的深入理解，新型酶反应的发现受到了极大的关注。其中，对酶催化氘掺入的研究仍处于起步阶段。最近有研究报导了了一种生物催化HIE工艺，用α-氧代胺合酶实现氘化α-氨基酸。作者认为生物催化氘化与硫胺二磷酸 (ThDP) 依赖性酶相关，其ThDP辅因子包含NHC 核心，并且能够通过 Breslow 中间体激活醛 C-H键。通过这种中间体，ThDP依赖性酶能够催化广泛的C-C键形成和裂解反应。作者假设形成的Breslow中间体可以在D₂O存在下进行HIE，将醛转化为其氘代类似物。然而，在相同条件下，CC 键形成反应（例如安息香缩合反应）在动力学上也是有利的，与醛的氘化相比，其在大多数ThDP依赖性酶的特异性结合口袋内更容易发生。因此，醛类通过 Breslow中间体进行氘化，同时阻断不需要的和竞争的 C-C 键形成途径，是一项重大挑战（方案 1C）。由ThDP依赖性酶催化的醛类的生物催化氘化反应尚未见报道。

酶可以通过改变结合口袋的形状，提高对特定反应的催化作用，从而控制竞争性反应。作者假设可以通过重塑酶的结合口袋来阻止竞争性的安息香缩合反应，从而抑制大型醛受体接近Breslow中间体，同时有利于催化较小的含氘底物（如D₂O）的反应，以获得所需的氘代醛。在分子动力学（MD）模拟的指导下，作者研究了几种ThDP依赖酶与苯甲醛的底物结合口袋，以评估所提出的HIE反应的可行性。MD平衡后，测量了供体 ThDP-苯甲醛络合物与受体苯甲醛的羰基之间的平均距离，这可能是影响安息香缩合的关键因素。如图 1 所示，苯甲酰甲酸脱羧酶 (BFD)、来自大肠杆菌的2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酸-6-羟基-3-1-环己烯-1-羧酸合酶(EcMenD)和来自假单胞菌荧光生物变种I的苯甲醛裂解酶(pfBAL)的结合口袋有足够大的空间来实现安息香缩合反应，因为在MD模拟中观察到的供体复合物和苯甲醛受体之间的距离相对较短 (4.6-5.6 Å)。然而，巴氏醋杆菌丙酮酸脱羧酶（ApPDC）在结合袋内的关键距离高达11Å。这一较长的距离表明，小的底物结合口袋为单一苯甲醛提供了足够的空间，同时阻止了安息香的形成；因此，这种酶被证明是催化HIE反应的潜在替代物。

作者随后评估ApPDC催化HIE与苯甲醛反应的可行性。ApPDC催化HIE与苯甲醛底物的反应以中等产率（69%）和高D-掺入（D-inc）（90%）生成2A（表 1, entry 1）。此外，如entry 7 所示，将温度提高到 37°C时，HIE 反应的产物产量最高。对照实验（entry 8 和 9）还表明 ThDP 和 ApPDC对于HIE 反应都是必不可少的。

然后使用ApPDC全酶催化一些具有取代基的芳香醛来评估HIE反应的范围。当4-甲氧基苯甲醛 (1b)和4-溴苯甲醛 (1e)作为WT酶催化反应的底物时，相应的产物D-inc <5%（表2）。由于芳环上的取代基增加了底物的体积，作者认为ApPDC狭窄的结合口袋没有足够的空间形成相应的Breslow中间体。先前研究表明，用合理的设计重塑ApPDC的结合袋可以以良好的活性催化苯甲醛生成（s）-安息香，这为将突变合理地引入到ApPDC酶的结构中以影响ApPDC催化HIE的反应性提供了动力：将结合口袋扩大到合适的大小，利于氘化产物的形成，同时抑制安息香缩合产物的形成。为了实现这一点，作者选择排列在酶顶部或底部结合侧的四个大型残基（T384、I468、E469和W388）作为突变热点。由于丙氨酸只有一个小的甲基，并且没有类似于甘氨酸的极易弯曲的骨架几何结构，因此将热点分别突变为丙氨酸以增加结合口袋的体积。如预期那样，与WT相比，W388A突变体表现出显著增强的HIE反应，导致高D-inc（表2）。

鉴于W388A突变体的成功，作者利用这种变体来进一步检测HIE反应的底物范围。如表 3 所示，所有含有功能性取代基的苯甲醛底物，如-OMe、-Me、-卤素和-CF3，都反应良好，产率高且D-inc (>90%) (2b- f,h-o)（除了2g和2p，它们的产率大约为50%）。有趣的是，苯甲醛上取代基的电子不影响酶对醛底物的反应性，芳香基上具有给电子、电子中性或吸电子基团的底物都可以顺利转化为相应的氘代产物。此外，芳香醛基的邻位、间位和对位取代基都是相容的，尽管大的邻位取代基如-Br（1g）对 HIE 反应的活性有轻微的负面影响（2g；表 3），这可能是醛基周围的空间位阻导致的。此外，对于一些相对较小的醛底物，例如测试的杂环醛（1r，s），与 W388A 突变体相比，WT-ApPDC以良好的产率和 D-inc 提供所需的氘代杂环醛（ 2r,s;表 3)。

有趣的是，W388A对体积更大的底物的催化活性显着降低，将 2-萘醛转化为其氘化产物 (2t)的 D-inc.仅为 47%；作者假设 W388A 的结合口袋无法提供足够的空间来容纳庞大的底物。为了扩大结合口袋以进一步增强反应性和D-inc，作者将热点（T384、I468、E469）丙氨酸替换突变分别引入W388A突变体中。W388A/I468A 双突变体对 2-萘醛（2t；表 3）显示出高产率 (95%) 和 D-inc (97%)。这种第二代突变体能够使取代的萘醛和多取代的苯甲醛顺利转移到相应的氘代化合物中，包括天然产物藜芦醛 (2t-z)。值得注意的是，依赖于 ThDP 的酶催化 HIE 反应也可用于制备其他具有生物活性的氘化分子。例如，非甾体抗炎药（如布洛芬）的后期修饰的衍生物也用 pfBAL 催化生成。pfBAL 是一种具有较大底物结合口袋的 ThDP 依赖性酶，以 73% 的产率和 94% 的 D-inc（2aa，表 3）产生所需的氘化产物。此外，通过结合 ApPDC 催化的 HIE 反应和 apfBAL 催化的安息香缩合反应的顺序，可以很容易地从1a中获得具有良好D-inc和 ee值的手性氘代安息香（2ab，表 3），进一步证明了该方法的合理性和实用性。

作者随后使用苯甲醛 (1a)和2-萘甲醛 (1t)作为测试底物来扩大HIE反应，以证明该方法的额外适用性。结果表明，这些反应在克级规模上，分别以80%的分离产率和97%的D-inc产生2a，以75%的分离产率和97%D-inc产生了2t。为了更好地理解氘化活性与特定蛋白质结构之间的关系，作者将4-甲氧基苯甲醛 (1b)分别与WT-ApPDC和W388A的结合进行了100ns MD模拟，并测量了MD 平衡后ThDP的碳烯中心与底物的羰基碳之间的距离（图2）。在WT-ApPDC的结合口袋中，观察到超过7Å的距离，表明大体积的色氨酸 (W388)显着阻止了醛底物接近 ThDP。而这种效应在突变体W388A中消失了，1b很容易被 W388A 扩大的结合口袋所接受，导致口袋中两个组分之间的距离更短，从而能够形成 Breslow 中间体。

整理：梁子琦

文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.1c03659