多重pcr引物设计注意事项（PCR引物设计遵循的规律）

简介

PCR反应的目的是扩増特异的DNA片段，同时不产生非特异的副产物.一般来说，每一个物理和化学的因子都可以改变，以増加PCR产物，提高特异性和敏感性。然而，在众多参数中要获得理想的结果，引物设计是至关重要的。即使其他所有参数都是最优的，引物设计不好可引起非特异的扩增和或引物二聚体形成，导致PCR产物较少或根本没有产物，接下来主要介绍PCR引物设计的一般规律。

引物长度

引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到PCR反应是否成功。多数情况下，引物长度约18～30bp，引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构(如发夹结构)出现的概率增大。

引物的解链温度

PCR反应的特异性更大程度上依赖于引物的解链温度(Tm值)，多数PCR反应最优的解链温度应在55～60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的Tm值取决于它的长度、序列组成和浓度，离子强度的影响可以忽略不计，因为不同的PCR反应盐浓度变化不大。一个反应中所有引物的解链温度应尽可能接近。对于多数PCR反应而言，引物之间的Tm差应小于2～3℃。差值增大，反应效率会降低，甚至直接导致反应失败。因为T.值高的引物在低于退火温度的条件下错配，而Tm值低的引物在高于退火温度的条件下与模板只有低浓度结合。

一般来说，退火温度比引物解链温度低5'C，但是，根据这一原则得出的退火温度常常并不是最优的，必须通过实验获得最优温度，利用梯度热循环仪根容易实现这一目的。

复制子的解链温度

除了计算引物的解链温度以外，还要保证产物的解链温度要足够低，以保证其在92℃时完全解链，一般来说，100～600bp的片段可以有效扩增，该参数有助于使PCR效率更高，但并不总是成功的PCR所必需的。

二级结构

设计引物时，另一个需要考虑的重要因素是二级结构的存在。一个带有自身同源序列的引物可以回折形成部分双链的发夹结构，类似地，引物之间的同源可能引起引物二聚体的形成，.PCR反应时，相对于模板而言，引物浓度高很多，引物之间相互退火要比引物与模板之间退火容易得多。因此，引物如果存在3'发夹结构或者3'二聚体，这对于PCR扩増往往是致命的，因为这样会导致非特异的大量背景产物的扩增.避免出现二级结构的最简单的方法是选择GC含量约50%、四种碱基中缺少一种的引物。

重复

同一碱基或几个核苷酸的重复也应尽量避免，不同的重复对PCR反应的影响不同。若简单重复，或引起引物二级结合位点，导致非特异扩增。若反向重复，或引起结合区内形成发夹结构，导致PCR效率不高。

GC夹

在引物的3'端包含一个G或C残基可增加引物扩增效率，这就是所谓的GC夹。

它可以促进引物的3'端正确地结合到模板，因为GC夹可以形成更为稳定的氢键。

非目标同源

利用BLAST程序对引物序列进行查找目标DNA其他区域内是否有非目标同源，若有，则会产生非特异片段，降低特异性。