海栖热孢菌：耐高温海栖热袍菌木聚糖酶XYN10B在设计和进化突变后的高温表现

今天推送的文章发表在Applied Microbiology and Biotechnology上的“High-temperature behavior of hyperthermostable Thermotoga maritimaxylanase XYN10B after designed and evolved mutations”，作者为中南民族大学生命科学学院的熊海容教授。

内切-1，4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的水解。它们是广泛存在的酶，参与木糖的生产，木糖是细胞代谢的主要碳源。半纤维素酶是一个通用的术语，用于描述用于解聚植物半纤维素的水解酶的混合物。内切木聚糖酶是主要的半纤维素酶之一，它随机水解木聚糖的β-1,4糖苷键，产生木寡糖和木糖。木聚糖酶在包括生物质水解或改性在内的各种工业应用中具有巨大的潜力。

耐热木聚糖酶广泛用于在高温下操作的生物技术过程。在高温下进行的工业过程中应用耐热酶有几个优点。此外，热稳定性酶有望与离子液体一起用于生物质处理。木聚糖酶的一个集中工业应用领域是植物细胞壁成分的解构，以促进纸浆漂白和从木质纤维素生产生物燃料。

理性设计和定向进化方法已广泛用于改善木聚糖酶的性质以满足工业应用的要求。此外，酶工程研究的一个主要目标是提高对结构-功能关系的理解。与理性设计不同，易错PCR等随机突变方法不需要广泛的蛋白质结构知识以及稳定性特性对结构特征的依赖性。因此，随机突变已被广泛应用于提高木聚糖酶的热稳定性、活性和嗜碱性。

本文作者研究了一种来自海栖热袍菌的耐高温的GH10木聚糖酶XYN10B(命名为TmXYN10B)，其表观最适温度为100 ℃，测定时间为30 min。定点突变和易错突变以及结构分析被用来对这种酶的功能产生新的理解。

TmXYN10B及其突变体的序列信息

通过基因合成获得密码子优化的TmXYN10B基因(GenBank登录号：KR078269)。氨基酸的编号遵循PDB结构1VBR中的编号。相应地，催化酸/碱为E647，亲核试剂为E753。TmXYN10B及其突变体的突变和氨基酸序列如表1.。当TmXYN10B的理论相对分子质量为38.6 kDa时，经SDS-PAGE分析，TmXYN10B及其突变体在35 kDa和45 kDa分子量标记之间出现一条蛋白质带(~42 kDa)，大小与蛋白质表达的328个氨基酸一致。

本研究调查了定点突变体XYNH（F806H，GenBank登录号OL444894）和XYNV（F806V，GenBank登录号OL444895），以及几个易错的PCR突变体。在易错PCR后，总共验证了121个活性突变菌落。在这121个突变体中，XYNA（D592G、V632A、K789E和I837M，GenBank登录号OL444891）、XYNB（N562D、T568M、R575G、D592G、V632A、D643G、K789E、Q792L和I837M，GenBank登录号和OL444892）和XYNC（N536I、M564K、D592G、V632A、K789E、L833W和I837M，GenBank登录号OL444893）被选择进行表征（表2）。XYNA是XYNB和XYNC的起始酶；因此，它包含几个常见的突变（表1）。

突变对热活性和稳定性的影响

温度依赖性活性图显示TmXYN10B、XYNA、XYNH和XYNV活性的最适温度可能高于100 °C（图1）。而随机突变体XYNB和XYNC分别在90 °C和70 °C表现出最高活性。

活性位点峡谷边缘的突变（XYNH中的F806H和XYNV中的F806V）显着提高了100 °C时的稳定性，因为半衰期增加了3倍以上，此外，熔化温度(T_m)略有增加（表2）。这表明极其耐热的TmXYN10B在其结构上仍有进一步稳定化的潜力。然而，随着稳定性的提高，比活性（表2）和催化性能降低，如V_max/K_m比（表2）所示。这表明这种耐高温的酶的稳定性已经很高，进一步增加它可能会损害活性值。尽管突变体XYNH和XYNV表现出较低的比活性，如表2所示，但当以提高热稳定性为主要目标时，可以容忍一些活性的降低。

计算TmXYN10B及其突变体半衰期的热稳定性图如图2所示。随机突变体XYNA在100 °C时显示出改善的半衰期，但在超过100 °C的温度下其稳定性降低（T_m略有下降）。这种XYNA表现的原因可能是存在可逆的构象变化，这些变化会恢复到正常构象，从而允许在高温下孵育后，当温度降低到70 °C时测量酶的活性。相反，在100 °C左右测量T_m时，可能的可逆构象变化出现并影响T_m值。因此，T_m在100 °C左右显示出稳定性降低，而100 °C下的半衰期显示XYNA稳定性增加。XYNA的K_m略有下降，从而提高了V_max/K_m，但这并未反映在其比活性上，仍处于野生型水平（表2）。这表明理论动力学值可能并不总是准确地反映标准测量条件下的活性。

XYNB和XYNC显示最佳温度急剧下降，表明部分或全部突变不稳定。XYNA、XYNB、XYNH和XYNV之间的pH最佳范围差异不大，在pH 5.5时具有最佳值，而XYNC在pH 6.0时表现出更高的活性（图3）。然而，XYNA、XYNB和XYNC的pH曲线比野生型或XYNH和XYNV窄得多。结果是在pH 4.5时木聚糖酶活性相对较低（图3）。因此，除了降低热稳定性外，XYNA、XYNB和XYNC的突变降低了它们对酸性和碱性条件的耐受性。

DSC和DSF分析

进行DSC以确定野生型TmXYN10B及其突变体在50至110 °C的温度范围内的T_m值。与TmXYN10B(104.9 °C)的T_m相比，XYNH和XYNV突变体的T_m值分别增加了0.9 °C(105.8 °C)和0.4 °C(105.3 °C)。然而，XYNA、XYNB和XYNC突变体的T_m值较低，分别为101.7 °C、93.7 °C和78.6 °C（表2，图4）。

DSF已在其他报告中用于确定木聚糖酶的热稳定性。在本研究中，DSF用于使用纯化酶确定TmXYN10B及其突变体的热稳定性。突变体XYNA、XYNB和XYNC的T_m^app值分别为97.6 °C、87.9 °C和73.5 °C，低于TmXYN10B。通过DSF测量的这些突变体的表观解链温度均低约5 °C，并且与通过DSC获得的值相对对应（表2）。另一方面，趋势曲线显示TmXYN10B、XYNH和XYNV的T_m^app值可能高于99 °C（图5）。因此，DSF值支持DSC获得的稳定性顺序结果。

突变体的结构分析

为TmXYN10B设计了活性位点突变，位于活性位点壁衬底物的806位（图6）。XYNH和XYNV中该位点的突变分别为F806H和F806V。His侧链可能与底物形成氢键（图6B），这可能导致XYNH的K_m略有下降（从野生型的0.51 mg/ml到XYNH的0.45 mg/ml）。然而，在XYNV中突变F806V后，比活性（但V_max没有那么多）同样降低（表2）。因此，似乎许多活性位点突变对于活性而言并不是最佳的，并且各种原因可以解释这种影响。

对接木四糖的分子动力学模拟显示F806H的delta-G能量最低。具有Phe和两个突变（F806V和F806L，后者未合成）的野生型显示出更高的delta-G能量（表3）。此外，即使没有底物存在，F806H的稳定性值也最高（根据在100 °C的DSC的T_m和T_half）。XYNH中的Arrhenius活化能降低（表2），表明这种突变也可能增加结构柔性，尽管稳定性显着增加。

F806在TmXYN10B结构中与附近的W802和F807侧链表现出疏水相互作用（图6A）。这些残基的侧链在活性位点形成一个强疏水补丁。Val的短侧链也有助于与W802和F807侧链的疏水堆积，这出乎意料地显着提高了热稳定性，但比活性降低。位置806处的Val没有与底物接触（图6C）。

整理：孙骁

文章信息：

DOI：10.1007/s00253-022-11823-3

文章链接：https://doi.org/10.1007/s00253-022-11823-3