植物转基因具体实验步骤（现存最原始的种子植物基因组大揭秘）

种子植物包括被子植物和裸子植物，裸子植物则分为四大类，即苏铁类、银杏类、松柏类和买麻藤类。裸子植物基因组较大，重复序列含量高，结构复杂。迄今为止，现存最原始种子植物苏铁分支尚缺少完整的基因组图谱，而苏铁基因组的发布，则代表人类完成了种子植物基因组演化研究的最后一块拼图。

2022年4月18日，《自然·植物》以封面文章在线发表了题为The Cycas genome and the early evolution of seed plants的研究工作。研究团队发布苏铁参考基因组信息，填补了种子植物基因组研究的空白，标志着种子植物各大分支的基因组均已覆盖，为后续开展比较基因组学研究奠定了基础。

论文封面

苏铁基因组选取苏铁类的基部类群，也是以现生苏铁类分布纬度最北的种类攀枝花苏铁（Cycas panzhihuaensis）为测序对象。基于长片段测序与MGI-SEQ测序，苏铁基因组组装大小为10.5 Gb，contig N50为12Mb，结合Hi-C数据，挂载为11条染色体（图一）。其中共注释32,353个蛋白编码基因，BUSCO评估完整度为91.6%，是目前裸子植物中最高质量的大基因组图谱。

图一：攀枝花苏铁的基因组特征，对应其11条染色体

裸子植物具有5大分支，约1118种。关于裸子植物内部大分支之间的系统演化关系一直有不同的学术观点。基于15个维管植物基因组3282个直系同源低拷贝核基因（图二a）、90个种子植物转录组1569个直系同源基因、72种维管植物叶绿体和线粒体基因组数据的系统分析结果表明，苏铁单独（线粒体数据）、或和银杏一起（核基因、叶绿体数据）构成其它所有裸子植物的姐妹群（图二b）。

图二：a) 基于核基因的种子植物系统发育树。b) 基于不同数据和方法推断种子植物的系统发育关系。

基因组加倍是植物演化适应的重要驱动力，关于裸子植物共同祖先是否经历了全基因组加倍事件一直存在争议。研究者采用对重复基因同义替代分析和系统发育基因组学方法，并使用基因组内共线性区域进行比较验证，发现现存裸子植物的最近共同祖先可能经历了一次古老的全基因组复制事件（命名为ω，图三a）。

伴随着种子植物起源，许多关键创新性状如种子发育、花粉、次生生长相关的基因家族均发生了创新或扩张。在种子植物的祖先节点共发现663个新获得的基因家族和368个扩张的基因家族。其中，106个新获得和55个显著扩张的基因家族与种子生理发育有关，包括调控胚胎早期发育、种子休眠和萌发、种子能量和营养代谢，种皮形成以及种子的免疫和应激反应等（图三b）。

图三：a) 基于系统发育关系推断种子植物的全基因组加倍事件。b) 种子植物的基因家族创新和扩张。

最显著扩张的种子生理相关家族是cupin蛋白家族。攀枝花苏铁编码一类新的vicilin-like贮藏蛋白 vicilin-like antimicrobial peptides（v-AMP），在基因组中呈串联基因阵列分布，多在授粉胚珠后期和受精胚珠时期表达，而后逐渐降低，暗示v-AMP基因在种子发育过程特定时期发挥重要作用（图四a,b）。LAFL家族（LEC1、ABI3、LEC2和FUS3）是种子发育核心调控基因，苏铁等裸子植物的FUS3和LEC2基因可构成一个新的进化枝，定义为FUS3 / LEC2-like类型，与被子植物的FUS3和LEC2形成姐妹分支关系。FUS3 / LEC2-like类别是裸子植物特有的。在攀枝花苏铁授粉后，其会表现出明显的表达，表明可能在裸子植物胚胎发生早期发挥特定作用 。

图四：a) Cuppin的系统发育树。b)在种子授粉受精过程中苏铁Cuppin基因转录本的表达水平。

苏铁类起源于古生代二叠纪早期，距今已有至少2亿7千万年历史。在经历大量灭绝以后，现代苏铁多是近期几次辐射演化的后代。如今苏铁具有2科10属。研究者基于现存苏铁目339种植物的转录组数据，重建了苏铁类自身的系统发育关系。分子钟分析表明，现存苏铁的多样化同步发生于距今1100至2000万年之间，是中新世以来气候剧烈变化的结果（图五）。

图五：苏铁目系统发育树支持现存苏铁是辐射演化的结果。

雌雄性别分化是一种进化性状。雌雄异株占到被子植物的6%，但在1118个已报道的裸子植物物种中却占到65%，而且苏铁类植物均为雌雄异株（图六）。苏铁雌雄植株形态类似，只有在开花时才能判断性别，然而苏铁生长缓慢，种植十年以上且环境适宜才会开花。研究苏铁性别决定的分子机制，可以在苗期确定其性别，对于苏铁类植物的就地和迁地保护，以及园林培育都具有重要意义。

在本研究中，对四川攀枝花苏铁国家级保护区的62株雌雄苏铁进行重测序，通过全基因组关联分析将苏铁性别差异区域定位在基因组的第8号染色体上。再通过对一个攀枝花苏铁雄株进行单分子测序和序列组装，得到45.5 Mb的雄株特异Y染色体序列，与相应的120 Mb雌株特异X染色体序列相比短了近80 Mb的序列，显示出明显的性染色体分化特征。通过对雌雄大小孢子叶进行转录组分析，发现表达差异最大的一个基因来自雄株的Y染色体，该基因编码MADS-box转录因子，推测其参与调控雄株小孢子叶的发育。在苏铁目泽米铁科和大泽米铁科的代表性物种中，也能在雄株基因组中检测到该转录因子的同源基因序列，说明了该性别决定机制在苏铁类植物中的保守性。

本研究通过组装得到苏铁X与Y染色体序列，揭示了苏铁性别决定的遗传机制，为苏铁类植物的野外雌雄空间分布格局研究和园林培育提供了理论基础。

图六：a) 攀枝花苏铁。b) 攀枝花苏铁雄株和雌株的孢子体 | 参考文献[1]

早期维管植物的精子都是有鞭毛，可以游动的。随着演化，鞭毛丢失。在现生种子植物中仅苏铁和银杏保留精子具鞭毛的特征。研究人员发现，苏铁和银杏均保留了大量鞭毛组装所需基因，但与苏铁相比，银杏中RSP类基因有一定的丢失（RSP2, RSP3, RSP 9, 和RSP11等）。此外，与鞭毛行使功能密切相关的外周致密纤维合成基因（ODFs），只在苏铁和银杏基因组中存在，在其它种子植物中则全部丢失（图七）——进一步证实了苏铁在种子植物演化中古老的地位。

图七，a) 苏铁鞭毛。b)植物演化过程中鞭毛的丢失。c) ODF和其它鞭毛相关基因的分布 | 参考文献[1]

水平基因转移泛指不同物种间的基因交流，在陆生植物适应性进化过程中起到推动作用。研究者在攀枝花苏铁基因组中发现一种细胞毒素蛋白基因（fitD），这种基因起源于细菌，通过水平基因转移的方式转移到真菌和苏铁中（图八a）。基于苏铁类339个物种转录组数据，研究人员发现该毒素蛋白只在苏铁属物种中存在。同时，fitD基因在种子和根部高表达，这可能也是苏铁种子和根部具有毒性的原因之一。基于基因重组技术，在大肠杆菌表达的毒素蛋白产物对小菜蛾和棉铃虫有显著致死性（图八b-f），显示出毒素蛋白具有一定的农业应用前景。

图八：a)苏铁水平转移毒蛋白基因的演化历史。b-f) 苏铁毒蛋白基因表达，及对昆虫毒性实验 | 参考文献[1]

参考文献

Liu, Y., Wang, S., Li, L. et al. The Cycas genome and the early evolution of seed plants. Nat. Plants 8, 389–401 (2022). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01129-7

作者：刘阳

编辑：酥鱼

排版：尹宁流

题图来源：Wikimedia Commons，Mercy / CC BY-SA 3.0（https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en）

研究团队

（共同）第一作者刘阳：深圳华大生命科学研究院、深圳仙湖植物园；王思博，李林洲、杨婷、魏桐：深圳华大生命科学研究院；董珊珊：深圳仙湖植物园；武生聃：兰州大学；刘勇波：中国环境科学院

（共同）通讯作者张寿洲：深圳仙湖植物园；刘欢：深圳华大生命科学研究院；龚洵：中科院昆明植物所；Douglas E. Soltis：美国佛罗里达大学；Yves Van de Peer：比利时根特大学。

论文信息

发布期刊 《自然·植物》Nature Plants

发布时间2022年4月18日

论文标题 The Cycas genome and the early evolution of seed plants

（DOI：https://doi.org/10.1038/s41477-022-01129-7）

未来光锥加速器是果壳硬科技发起的早期科技创业加速器，为科学家创业提供从公司注册、知识产权，到融资需求、团队组建等不同阶段的方案建议。加速科技成果从实验室到市场的转化，加速一部分科学家迭代成为CEO。

果壳团队有着长达12年为科学家服务的经验，我们始终站在科学家的视角出谋划策，做科创者的好朋友。如果您正打算创办一家科技企业，无论是找钱，找人，找资源，还是找订单，都欢迎与未来光锥团队聊聊。您可发送bp或其他项目资料到wlgz@guokr.com，并留下联系方式，或添加果壳硬科技企业微信，私信沟通。

✦

✦

,