单克隆抗体的制备过程中注意事项（单克隆抗体CEX中双峰出现分子机制及解决方案）

阳离子交换层析（CEX）在单克隆抗体纯化过程中作为重要的纯化工具,但是它的实用因蛋白本身化学特性的不同而产生意外的纯化效果。例如，蛋白质跟树脂之间的相互作用引起IgG1构型的改变，因而引起在CEX中出现双峰的现象。双峰的出现不仅影响蛋白质收率的下降及会引起下游工艺开发时间的增加，人力和时间的浪费。因此，在下游工艺纯化过程中要求有效的解决双峰。

CEX中引起双峰出现原因有好几种，比如有些mAb因外表电荷的高浓度的修饰引起的强和弱的结合而出现的双峰现象，这主要跟mAb中的组氨酸有关系。组氨酸是在20种氨基酸当中在蛋白质里出现最频繁的氨基酸，它的带电荷或者中性受到溶液的pH范围。组氨酸残基在疏水性条件下会有酸性pKa及表现慢性质子化现象。因此，mAb在CEX中双峰的出现跟组氨酸在重链中出现位置及它的不同程度的质子化性质有关系（图1）。

图1 双峰现象跟蛋白外表组氨酸残基之间的相关性(A)

mAb中的组氨酸残基分布解释图和CEX中双峰现象（B）

图2高纯度的mAb在POROS HS50（强CEX）层析柱线性盐梯度洗脱过程中出现双峰（A），两个峰不仅都含有高纯度的mAb还将两种峰重新进入柱子分别纯化时出现同样洗脱峰（B）。且在不同上样载量情况下出现同样的洗脱峰现象（C），说明上样载量不会引起双峰且第一个和第二个峰没有显著生物学差异。

图2 mAb在 POROS HS50中盐梯度洗脱时双峰现象

除了组氨酸残基之外洗脱液和洗涤液中的盐浓度液也会影响双峰现象，图2，3 mAb在 POROS HS50柱子上结合后用含 0.1MNaCl的Wash 2 冲洗 (第一个峰对应的盐浓度)时洗脱下来了有些蛋白，冲洗液盐浓度降到80mM时没有洗脱下来蛋白而且洗脱后的峰跟对照比较第一峰小，第二峰变得大了（图3A）；在洗脱条件不变的情况下，通过改变上样条件加0.10 NaCl时第一个洗脱峰比没有加0.1MNaCl明显变小且跟0.1M ArgHCl处理结果一样的（图3B）。表明mAb通过强和弱等两种结合模式跟柱子结合，80mM NaCl能将第一个峰洗脱下来，但是洗脱下来的蛋白通过强结合方式跟柱子重新结合。上样溶液里加的0.10 NaCl帮助mAb强结合模式跟柱子结合减少弱结合。

图3 mAb在CEX中不同条件处理下的洗脱峰

图4 mAb在 POROS HS50柱子上结合后用不同pH(4.3-6.5)洗脱液洗脱后都出现宽度不一样的双峰，但是在高pH条件下出现大前锋而小后峰。pH4.6时后峰占优势; pH5.0时后峰依然占优势但是前锋变大；pH5.2时出现大小一样的两个峰；pH5.4和pH5.8时前锋占优势。这趋势明显的显示前后峰的比例受到洗脱液pH的影响。在mAb中的带电荷基团中，组氨酸残基是在pKa值pH6.0时变电荷受体,它pKa值范围pH(4.5-7.5),在质子化的环境中带正电荷，在非质子化条件下是中性的。差 1电荷的蛋白亚型就像天然mAb和脱酰胺基的mAb在CEX中出现多峰现象，表明组氨酸残基跟双峰的产生有关的（图4）。

图4 不同pH洗脱条件对双峰产生的影响

除了洗脱盐浓度，pH和上样条件之外CEX填料的筛选也会影响双峰的出现，图5中可以看出POROS HS50, Fractogel SO3-(M),Eshmuno CPX 和monolithic CIM multus SO3- columns CEX层析柱中出现双峰；Nuvia S, Source 30S,和Sepharose SP FF 层析柱中出现驼峰; 只在Toyopearl SP 650M 层析柱中出现单峰，因此选合适的层析填料也是解决双峰的最快的方案之一。

图5 不同层析填料对双峰产生的影响

总结，单克隆抗体在CEX纯化过程中出现的双峰因它在柱子内的结合方式的不同而导致的，组氨酸残基带电荷状态的不一样而导致的这种结合方式（强和弱结合）受到pH,温度，洗脱盐浓度，柱内保留时间等因素的影响。以上几个实验结果可以看出，选择合适的洗脱pH,洗脱盐浓度及合适的填料解决双峰过程中起着很重要的作用，洗脱pH控制在4.6时可有效地降低前锋面积；洗脱pH不变条件下将洗脱盐浓度降到80mm时,可有效地消除双峰现象；洗脱pH,盐浓度不变的条件下可以考虑换CEX填料进行优化。根据自己项目实际情况选合适的解决方案。