微生物按致病性分类（类器官与免疫学研究）

类器官简介：类器官是一种新兴的更加接近体内生理性状的一种3D细胞培养技术，通常由多能干细胞PSC或成体干细胞ASC在合适的培养条件下，培养分化形成的一种类似原对应器官的3D细胞结构，其细胞组成种类和细胞的排列顺序与对应的器官相同或者相近。

类器官技术兴起之后，迅速应用于癌症与肿瘤的研究，各种肿瘤类器官培养方法不断的涌现，相对于动物模型，类器官成本低、时间短、生理相关性更高。癌症细胞系大多是2D培养，在成系的过程中已经有了适应驯化甚至发生了基因变异，与细胞系相比肿瘤类器官类器官生理相关性更高，更加接近体内的真实状况。

目前世界各国纷纷建立PDO（病人来源的肿瘤类器官）样本库，用类器官进行免疫治疗的研究与验证，也越来越流行，频频见于CNS知名科研杂志的文章。

今天给大家隆重介绍类器官大神Hans Clevers与去年12月18号发表于Nature 期刊的一篇类器官在免疫学研究中的应用综述。

Clevers是成体上皮类器官的权威学者，因此本文主要对免疫学中如何运用类器官技术研究上皮-免疫细胞的相互作用，以及这种相互作用在组织发育、稳态和疾病如癌症中的角色。

上皮组织是人体与外界的屏障，例如皮肤，胃肠道，肺脏和胸腺。在《肠道衰老与代谢二》中对肠道的屏障作用有所论述。

除了血液和淋巴结，免疫细胞在上皮组织中的含量最高，免疫细胞也直接的和上皮细胞相互作用。这种相互作用对免疫细胞的成熟（胸腺）和激活（如伤口）有一定的作用。

上皮组织是接触病原体的第一道防线，和免疫系统一起对病原体的感染快速的反应。但是不同组织器官的上皮组织对病原体的反应是不同的，甚至同一个器官，例如肠道，在不同的肠段，上皮的组成和微生物组也不同，对应的组织驻留的免疫细胞也不同。

这种错综复杂的上皮-免疫相互作用不但是预防和控制病原感染的前提，同时对阻止过度免疫激活也非常重要。

传统的研究上皮-免疫相互作用的模型已经建立多年，在feeder饲养层上培养上皮干细胞已经有50多年的历史。近期建立的一些上皮类器官，如肠道，皮肤，肝脏等，模拟了体内的环境可以作为体外实验的模型。具体的类器官培养体系的建立，可以购买stemcell的试剂盒。基本的套路就是在细胞外基质的支撑下，合适的细胞因子，成体上皮干细胞就会自发的组织形成3D细胞结构。用多能干细胞也可以分化形成上皮种类的类器官（如肠道，肝脏）。

肠道类器官示意图

与基于饲养层2D细胞培养对比，类器官技术可以在确定的条件下对干细胞进行长期的扩增和分化，不受血清批次差异的影响。同时类器官含有原组织中对应的多种细胞类型（如上图），在长期的传代中可以保持基因型和表型的稳定。这些特点让类器官应用广泛，同时也可以进行多种实验，例如成像，分子，基因编辑等。

类器官技术也简化了上皮-免疫细胞之间相互作用的研究，随着癌症类器官模型的建立和其他的免疫学疾病如炎症肠病IBD研究模型的建立，免疫系统在上皮疾病中的病理机理可以被进一步研究。

Stemcell 类器官产品

自从用了stemcell的类器官，节省了大量的摸索自配时间，有了问题还能咨询厂家技术专家，稳定可靠的产品才能支持稳定可靠的实验结论，才能发CNS。

类器官技术也可以整合到器官芯片（organoid on chip）平台中，建立更加复杂的培养系统。如果多种类器官集成在一个器官芯片上，完全可以模拟药物在体内的流转过程，比如在胃肠道中消化，然后到肝脏中代谢，然后再转到靶器官，然后在到肾脏排出。这种前景想想就激动。

其他的高级玩法包括：1）翻转极性，2）融合到管子上，形成更接近体内的管状结构，3）转为2D培养。

与动物模型相比，类器官可以更加简化的直接研究不同细胞的相互作用，另外动物和人类之间有着巨大的区别，因此动物研究转化到人类医学应用会面临复杂的问题，例如有些研究尤其是神经系统无法用动物模型研究转化。

考虑到这些因素，类器官在免疫学的研究中就非常有用了。虽然如此说，但是这个领域还处于幼儿期。在可以预见的未来，类器官技术还是需要其他的技术方法的补充配合，例如动物模型，才能更加全面的理解复杂的免疫相互作用。

这篇文章讨论了最前沿的在免疫学研究中类器官的应用，重点突出了以下几个方面：1）组织发育和成体稳态中上皮-免疫相互作用，2）组织再生中的免疫系统的作用，3）炎症疾病和肿瘤微环境。同时也讨论了类器官在免疫治疗中的应用和临床应用中需要克服的挑战。

后面两期的内容如下：

类器官与免疫学研究中篇

胚胎发育

由于Mouse在出生之后外周组织中才会出现淋巴细胞，因此研究人类胚胎肠道和免疫细胞的相互作用需要新的技术方法。因此用mouse和human胚胎肠道产生的类器官可用于胚胎发育时期的上皮-免疫细胞相互作用。

例如近期的一个研究鉴定了一群CD4 CD69 的Tem效应记忆细胞，可以产生肿瘤坏死因子TNF并表达基因促进上皮细胞的生长和增殖。这个研究用了人类胚胎肠道类器官，发现低剂量的TNF可以支持肠道干细胞ISC的增殖，然而高剂量的TNF会诱导肠道干细胞ISC凋亡并因此会阻断肠道干细胞ISC的扩增。

和上面结果一致的是，类器官和少量的自体胚胎Tem共培养会增强类器官的生长，这种增强效果可以被TNF抑制阻断。相反，大量的Tem和类器官共培养会抑制类器官的生长，同样也可以用阻断TNF逆转。

这个类器官系统可以作为研究新生儿坏死性小肠结肠炎的模型，因为患儿的Tem数量比正常儿童高很多。

这个研究表明胚胎来源的类器官可以方便的用于研究疾病相关的上皮-免疫相互作用。

成体稳态

如前面所提到的，上皮-免疫相互作用在维持哺乳动物稳态平衡扮演了重要的角色，包括免疫细胞的发育，边界组织（皮肤和小肠等）的动态平衡。下面就探讨类器官在研究这些动态平衡中的应用。

胸腺类器官研究T细胞发育

胸腺是T细胞发育成熟的地方。T祖细胞从骨髓到胸腺皮质进行阳性筛选，然后在髓质进行阴性筛选。胸腺的这些区域包含了两种不同的上皮细胞：皮质胸腺上皮细胞cTEC和髓质胸腺上皮细胞mTEC。

重新构建胸腺的3D环境对研究胸腺的功能是非常关键的。已经有多个胸腺类器官的方法被报道。大部分是用胚胎或者新生的mouse或者human的胸腺组织建立的胸腺类器官，但是也有报道用人胚胎干细胞分化为胸腺类器官。这些类似胸腺的结构都可以产生有活性的T细胞并且可以移植到裸鼠中发挥功能。有趣的是，虽然长期的培养是可能的（最长56天），但是连续传代之后，细胞丧失了克隆形成能力。

因此克服长期培养的挑战是未来的一个方向。

虽然双功能TEC前体在成年鼠中被描述（然而有争议），但是目前还不能用单个干细胞产生同时包含cTEC和mTEC的胸腺类器官。

在很多的疾病中，胸腺都会失去功能，因此研究胸腺上皮和免疫细胞之间的相互作用是有益处的。

上皮细胞作为细菌的免疫哨兵

上皮细胞是身体防御病原体的的重要组成部分，因此会表达各种识别病原体的受体。如上期所提及，不同的上皮组织有不同的微生物，那么上皮细胞识别的受体也不同，即使在同一器官也是如此，典型的例子就是肠道。不同的肠道的TLR的表达是不同的，同样不同位置产生的肠道类器官也忠实的反映了不同的表达模式。此外，下游用微生物产物刺激不同的TLR发生的转录组学的变化也是不同的。

这些数据说明，肠道中基础的TLR的表达模式不依赖于微生物和免疫细胞。

然而，尽管用TLR配体刺激类器官诱导产生了特异性的抗微生物的基因表达谱，但是抗微生物的多肽却不是TLR刺激诱导产生的，而是免疫细胞分泌的细胞因子诱导产生的。

尽管潘氏细胞表达TLR5，但是诱导潘氏细胞去颗粒化和extrusion的不是TLR5的配体，反而是IFN-(。

这些观察强调了上皮，共生微生物和免疫系统之间的相互作用的复杂性。让复杂性更一步的是，额外的细胞类型，例如上皮下面的基质细胞，肠神经元，都会同时影响上皮细胞和免疫系统。

免疫复合物影响上皮细胞的分化

用上皮类器官和不同的细胞共培养,可以在体外研究上皮细胞和其他细胞之间的复杂相互作用。数个近期的研究表明免疫细胞分泌的细胞因子和微生物会显著的影响上皮细胞的分化。

最典型的例子就是M细胞。M细胞是一种负责转运的细胞，位于覆盖在粘膜相关淋巴组织上的滤泡上皮，例如肠道的Peyer's贴片或者相似的呼吸道组织就是这种类型的滤泡上皮。

通过把腔内的物质运输到滤泡上皮下面的造血细胞，M细胞在诱导免疫反应中扮演了重要的角色。缺少M细胞mouse 分泌性的IgA下降并且生态失调。在肠道中，M 细胞由Lgr5 阳性的肠道干细胞分化而来。M细胞的分化需要NK-KB配基RANKL的刺激信号，RANKL由临近滤泡上皮的基质细胞表达。RANKL刺激之后会表达M细胞的早期标志物SPIB。

如果肠道类器官培养基中没有RANKL，则肠道类器官中就没有M细胞，这就说明肠道干细胞需要外部信号才能分化为M 细胞。

M细胞极为稀有，同样稀有的还有tuft细胞和肠内分泌细胞，这就说起了肠道类器官的另外一个重要作用，就是可以扩增研究这些极为稀有的细胞。

利用类器官研究这些极为稀有的细胞，有时候会有意想不到的结果。例如基于动物实验，人们假设IL22信号会导致M细胞的数量下降，但是在RANKL处理培养的类器官中加入IL22, 并没有改变M细胞相关基因的表达水平。这说明IL22的信号不是直接作用于M细胞的分化。具体的机理还不清楚，可以继续研究发文章啊。

免疫细胞分泌的细胞因子也会影响上皮细胞的分化。例如IL13可以在mouse 肠道类器官中诱导杯状细胞的分化，而上皮细胞分泌的IL33可以增强ILC2的IL13的表达。IL13和IL14可以诱导肠道类器官中tuft细胞的分化。文中还有大段的论述，不在一一的翻译。这些结果和发现都是用肠道类器官和各种免疫细胞共培养做出来的。所以啊，类器官是免疫细胞的共培养是研究免疫和成体干细胞分化的利器。

与上皮细胞的相互作用影响免疫细胞的表型

上面说的是免疫细胞及其分泌的细胞因子对上皮细胞分化的影响，那么这一部分就是反过来论述与上皮细胞的相互作用也会影响免疫细胞的表型。

上面的部分通过简单的类器官共培养就*能出这么多的信息量巨大的成果。然后驱动粘膜免疫的上皮-免疫细胞相互作用，不仅仅是通过可溶性因子调节。在多种组织中都有一群驻留在组织中的淋巴细胞被称为上皮细胞间淋巴 细胞IELs，例如在肠道和其他组织中驻留的T细胞。这些驻留型的CD4/CD8T细胞要么是在胸腺中发育的，要么是在感染之后留在组织中的记忆性细胞。

在mouse，只要靠近上皮细胞就足以改变T细胞的表型。这点也通过类器官共培养实验验证，mouse肠道类器官培养基中添加T细胞存活必须的细胞因子就可以扩增和维持IELs。另外，OVA特异的在体外激活的脾脏naïve CD8 T 细胞，在和表达OVA多肽的肠道类器官共培养的时候获得了IEL的表型，说明了抗原特异的相互作用参与了这个分化的过程。

近期有研究发现mouse一个肠道干细胞的亚群可以行使非经典的抗原呈递功能，通过抗原呈递，这些肠道干细胞ISC激活了肠道粘膜固有层的CD4T细胞，从而产生了各种各样的Th细胞分泌的细胞因子，这些细胞因子又反过来影响了肠道上皮的分化。有意思的是肠道类器官和抗原特异性的naïve CD4共培养并没有激活T细胞，但是经过分选的肠道干细胞ISC和T细胞共培养却可以激活T细胞。这种差别也许可以用类器官中肠道干细胞ISC比例太低解释。

还有很多未解之谜等着用类器官共培养的方法去发现去探索，后面举了很多例子，不再一一列举。

类器官共培养的技术也可以用于研究宿主和病原的相互作用，类器官共培养的研究证明可以用类器官作为研究微生物存活和增殖的的模型。尽管这些研究集中在病原体，类器官技术可以用于评估在共生菌存在的情况下免疫-上皮相互作用对肠道动态平衡的影响。通过微生物condition的培养基配合mouse 肠道类器官，发现微生物代谢物（主要是短链脂肪酸，简称SCFA）可以极大的影响mouse肠道类器官的基因转录。也有很强悍的证据说微生物代谢产物可以影响肠道的免疫系统。通过微生物代谢无得免疫调节功能，这些短链脂肪酸SCFA也许可以保护粘膜炎症和阻止肿瘤生成。

然而上皮细胞在免疫细胞对微生物代谢物的反应中的作用还不清楚。微生物代谢物，上皮细胞，免疫系统这三者之间的复杂相互作用，非常值得研究，而且这三者之间的共培养是研究这个问题的重要工具。

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