pcr技术引物设计原则（Real-TimePCR引物设计案例实操版）

作者：阳光

引物设计道理听了很多，依然做不好一个引物设计？你需要的是实战演习！废话不多说，案例搬上来：

引物设计具体操作，以设计TP53引物为例

1）首先在NCBI中输入基因

3）找到该基因的mRNA序列

5）点击Pick Primer，进入引物设计界面，系统自动把该基因的序列输入到了里面，也可以把你任何想要设计引物的序列输入到对应的框中，设计针对该序列的引物

6）将扩增产物大小设置为100-150

7）点击下方的Get Primer

8）选择并提交

9）提交后即可得到引物序列

10）根据引物设计的原则筛选合适的引物

引物设计原则

1）扩增产物长度100 bp-150 bp为佳；

2）引物长度17 bp-25 bp最好；

3）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。Tm值调整至60℃-65℃为佳；

4）引物的GC含量控制在40%-60%之间，最佳为45%-55%；

5）引物3'末端碱基最好为G或C或A，避免使用T；

6）避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列，二条引物之间的3'端避开有2个碱基以上的互补序列；

7）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3'端，必须避开GC含量不均匀的区域；

8）最好跨内含子设计引物。

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