黑木耳母种制备（黑木耳母种培养基配制后的接种与培养）

1.固体菌种生产：

固体菌种是菌丝体生长在固体培养基中而形成的固体形态菌种。 试管母种（1级种） 菌种通常被分为3级。1级种也叫母种或试管种，可用组织分离法或孢子分离法获得母种。2级种也叫原种，是利用母种的菌丝体接入木屑培养基中所产生的菌种。3级种也叫栽培种，是利用原种再扩繁一次所产生的菌种，它直接用于生产，因此也叫生产种。 经过母种—原种—栽培种的不断扩大繁殖后，菌丝体的数量越来越多，越来越强壮，利用这样的菌丝体投入生产就可以生长出优良的子实体。

母种培养基的配制：

（1）常用配方：马铃薯200克、白糖20克、琼脂20克、水1000毫升。为了强化营养，有条件的生产者可在上述培养基中添加蛋白胨3.0克、磷酸二氢钾3.0克、硫酸镁1.5克。

（2）配制方法：首先把马铃薯削皮、切片、水煮，八分熟后取其汁液，再将汁液小火加热，放入琼脂、白糖。溶化后把培养基装入规格为18毫米×180毫米的试管中，装入高度为管长的1/4或1/5为适宜。分装后试管塞紧棉塞，每7支捆成1捆，用牛皮纸包扎，准备灭菌。

（3）培养基灭菌：用手提式高压蒸汽灭菌锅或家用高压锅灭菌，在0.12兆帕压力下（锅内温度121℃）灭菌40分钟。待温度降至60℃时取出摆斜面，斜面长度最好占管长的2/3左右比较合适。

2.菌种分离与扩大培养：

菌种分离方法有孢子分离法、组织分离法、耳木分离法。孢子分离法是选用当年生无杂菌污染的鲜耳片，以黑、厚、大为佳，经无菌水冲洗几次，用丝线将耳片腹面向下吊挂，另一端吊挂在装有培养基的三角瓶口部，加棉塞封口，在25～28℃温箱中接收孢子并培养成菌丝体。组织分离法是选用优质耳片，表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片约2分钟，剪取远离耳基没有筋的部位约0.2平方厘米。在无菌条件下，接入试管斜面培养基上，经28℃左右的温度培养长出菌丝体。

耳木分离法是从黑木耳的段木中分离菌丝体获得菌种的方法。切取火柴头大小的木块，经过消毒，在无菌条件下接入试管斜面，经25～28℃的培养就能长出菌丝体。在菌种分离时，要在接种箱中或接种室超净工作台上进行无菌操作，防止杂菌污染。分离几天后在试管斜面上就会长出白色的绒毛状黑木耳菌丝。经过10天左右的培养，菌丝可长满斜面，这就是母种。分离成功的试管母种，还可以在试管斜面培养基上扩大繁殖1～3次，这个过程称为转管或扩管，也叫传代。一般1支母种可转30～40支母种，从而满足生产上的需要。

3.原种与栽培种生产：原种及栽培种的培养基是通用的，其种类很多，下面仅介绍常用的木屑培养基：

（1）培养基配方：培养基常用配方为阔叶树木屑78%，麦麸或米糠20%，蔗糖1%，石膏1%（简称782011）。

（2）配制方法：先把木屑过筛，将木屑、麦麸或米糠、石膏混合均匀，再用熔化的糖水拌料，使培养料的含水量达到60%左右。测定方法是用手紧握培养料，指缝间稍有水印而不成滴。

（3）培养基装瓶与装袋：一般用瓶子生产原种。培养基配好后，即可装入制种瓶中，装至瓶肩，料面压平。培养料在瓶中要求上紧下松，中间用木锥扎1个孔。瓶口内外要擦净，广口瓶用丙烯膜或乙烯膜及胶圈封口（丙烯膜适合高压蒸汽灭菌，乙烯膜适合常压蒸汽灭菌），小口瓶用棉塞封口。 一般用塑料袋生产栽培种，聚乙烯袋适合常压蒸汽灭菌，聚丙烯袋适合高压蒸汽灭菌。袋的大小以33厘米×17厘米×0.005厘米较为适合。装袋时要保证松紧适当，装袋后套上套环，插入接种棒，用棉塞塞紧或封专用塑料盖。装袋时对料袋要轻拿轻放，防止沙粒或杂物将袋刺破引起污染。

（4）培养基灭菌：原种及栽培种培养基装瓶装袋后再装入铁筐或塑料筐内准备灭菌。灭菌方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌两种。采用常压蒸汽灭菌时，锅内温度达到100℃后要保持8小时以上。采用高压蒸汽灭菌时，锅内在0.15兆帕压力下（锅内温度127℃）灭菌1.5小时。 常压蒸汽灭菌锅可自行修建，高压蒸汽灭菌锅或灭菌柜一定要从正规厂家购买，以保证安全生产。

4.接种与培养：

（1）接种：经过灭菌后的瓶或袋，待料温降到30℃以下后，搬入接种箱、接种帐或接种室进行接种。接种前，将接种器具、物品搬入接种场所。这些器具和物品主要有接种匙、镊子、酒精灯、酒精棉球、菌种、待接种的料袋。物品放好后，再用气雾消毒剂进行熏蒸消毒，40分钟后方可使用。 原种是由母种扩接到原种培养基上而得到的菌种，栽培种是由原种扩接到栽培种培养基上而得到的菌种。用原种接栽培种时首先要先拔出料袋内的接种棒再进行接种。

（2）培养：培养场所在使用前也要用气雾消毒剂进行熏蒸消毒。温度控制在25～28℃，空间适宜的相对湿度为60%左右，要暗光养菌并经常通风换气，培养过程中要经常检查有无杂菌污染。菌种长好后放在低温、干燥、清洁处避光保藏，准备使用。另外，栽培种不宜再做菌种扩大繁殖。

5.无菌接种操作程序：首先将接种箱、接种室收拾干净，放入培养基、菌种、接种用具。用气雾消毒粉进行熏蒸消毒，每立方米空间用量1包（5克），置于容器中点燃，保持40分钟以上。用75%酒精棉擦抹双手。点燃酒精灯，接种工具灼烧灭菌后开始接种。接种时一定要保持无菌操作，培养基接种后移到培养室进行培养。