发酵生产酪氨酸酶（J.Agric.Food）

大家好，今天推送的文章来自于发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上的“ Production of Cinnamaldehyde through Whole-Cell Bioconversion from trans-Cinnamic Acid Using Engineered Corynebacterium glutamicum”，通讯作者为化学与生物分子工程系和生物世纪研究所的Ki Jun Jeong。

肉桂醛(CAD)是肉桂植物生产的肉桂精油的主要成分，因其独特的香气传统上被用作食品添加剂。近年来，人们对CAD的功能特性进行了研究。人们发现，CAD可以抑制食品病原体/食品腐败细菌，防止寄生线虫感染植物，而寄生线虫是作物生产力损失的原因之一。此外，在医学应用方面，CAD已被报道能有效抑制癌细胞转移到肺部、卵巢和中枢神经系统，并促进放热和代谢反应。由于CAD的广泛适用性，近年来对CAD生产的研究显著增加。CAD可以从肉桂植物中提取;然而，CAD在植物中的生产依赖于植物的生命周期、气候条件和对植物病害的易感性。同时，有机化学合成CAD成本低廉，目前占CAD生产的绝大部分。有机化学合成是CAD生产的主要方法，苯甲醛衍生物与乙醛在碱性条件下反应;然而，合成过程中产生的副产物可以作为造成环境污染的因素，并有可能在下游应用中造成安全问题在这方面，利用微生物的生物方法高效生产CAD的替代策略引起了人们的关注。

谷氨酸棒杆菌是一种工业微生物，用于生产化妆品中的L-氨基酸、蛋白质和化合物。.谷氨酸梭菌因以下特点被认为是工业相关生物技术生产的有希望的宿主：（一）它具有高细胞密度生长的能力，从而产生高产量的目标产品；（二）被认定为安全生产场所；（三）谷氨酰胺梭菌优化遗传工具的最新进展可实现广泛的工业应用。因此，许多研究最近报道了一种全细胞生物转化设计，使用谷氨酸梭菌生产各种化学品，包括苯丙烷衍生化合物。

作者之前报道了谷氨酸梭菌从L-苯丙氨酸生物合成t-CA的工程。通过将谷氨酸梭菌作为生物催化剂与基于微膜的细胞回收系统相结合，成功开发了一种转化率为75%的高效生物转化工艺。在本研究中，作者在工程化谷氨酸梭菌中开发了一个全细胞生物催化剂系统，以有效地从t-CA生产CAD。

作者首先构建了草分枝杆菌羧酸还原酶（MpCAR）基因的表达系统，用于t-CA直接转化为CAD。为了提高CAD的生物转化率，谷氨酸梭菌中可能参与CAD转化为肉桂醇（CAL）的基因被删除。此外，作者还通过增加NADPH池（t-CA转化所需的辅助因子）来检测转化效率。最后，删除vdh基因以防止产生的CAD反向转化为tCA，并开发了以谷氨酸梭菌作为全细胞生物催化剂的生物转化工艺，具有较高的CAD转化效率。

为了建立CAD生产的一步生物转化工艺，羧酸还原酶被认为是一种适合引入谷氨酸梭菌的催化剂。在微生物中，CAR催化脂肪族脂肪酸和芳香族羧酸还原为相应的醛形式，以牺牲ATP（三磷酸腺苷）和NADPH来产生AMP（一磷酸腺苷）， PPi（焦磷酸盐）和NADP 作为副产品。此外，由于苯丙酸（包括苯甲酸、阿魏酸，甚至t-CA）具有广泛的底物特异性，CAR有可能成为通过微生物细胞工厂生产香兰素、苯甲醛和CAD等芳香醛的工具箱的一部分。据报道，草分枝杆菌羧酸还原酶（MpCAR）比其他细菌或真菌的CAR具有更高的酶活性。因此，作者使用MpCAR为CAD构建生物转化系统。MpCAR基因被克隆到一个高拷贝数的质粒pHCMS中，其中MpCAR基因在合成组成启动子（PH36）的控制下表达。

接下来，为了确保经济可行性，作者通过对含有pYHP和pHB-Trc-CA的工程大肠杆菌YHP05进行补料分批发酵，使用发酵液中存在的粗t-CA底物评估CAD生产。在使用pHCMSMpCAR转化谷氨酸梭菌后，在摇瓶中评估重组菌株MpV1。细胞生长16小时以达到固定相。之后，立即将含有t-CA23的发酵液添加到细胞中，以分析CAD生产效率。如下图所示，1.2 g\/L的t-CA被迅速转化为CAD，0.7 g\/L的CAD在45分钟时转化率为0.9 g\/L\/h，产率为65%（0.65 mol\/mol）。然而，CAD的产率随着时间的推移逐渐降低，在生物转化反应过程中，CAL逐渐生成至100 mg/L。在这方面，作者假设谷氨酸梭菌的细胞内代谢途径将合成的CAD转化为CAL。

细菌宿主体内的内源性还原酶和脱氢酶可以自发地将醛分子转化为醇。因此，许多研究提出了不同的方法来去除假定的基因，以提高醛生物合成的效率。基于BLAST搜索和基因组序列分析，作者预测以下三个基因与谷氨酸梭菌中CAD转化为CAL有关：adhC编码乙醇脱氢酶，dkgA编码2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶，cg1176编码短链脱氢酶。所有这些基因都从MpV1的染色体上删除，产生的工程菌株被命名为MpV5-3。如下图所示，与MpV1中45分钟后CAD的损失相反，MpV5-3表现出CAD的持续产生，并且CAL的产生减少到约10 mg/L。基于这些发现，很明显阻断CAL转化途径有助于提高CAD产量。

在生物系统中，许多酶需要持续供应辅助因子，如ATP和NADPH，各种辅助因子补充策略已成功用于提高产量。CAR是一种将t-CA转化为CAD的酶，也需要ATP和NADPH，作者假设，如MpV5-3中所观察到的，tCA的不完全消耗可归因于辅助因子的补充不足。因此，作者随后专注于增加NADPH库。在谷氨酸梭菌中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是一种通过磷酸戊糖途径参与NADPH生成的酶。为了增加MpV5-3菌株细胞质中的NADPH池，作者将编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因的假定启动子区域替换为PH36启动子，22产生了菌株MpV7-3。如下图B所示，与MpV5-3相比，MpV7-3细胞质中的NADPH浓度增加了约1.5倍。之后，在2L生物反应器培养中评估了用MpV7-3将t-CA转化为CAD的效果。MpV7-3培养7小时，直到OD600达到50 。

香草醛脱氢酶（VDH）是一种利用香草醛（4-羟基-4-乙氧基苯甲醛）生产香草醛酸（4-羟基-3-甲氧基苯甲酸）的酶。据报道，谷氨酸梭菌中假定的VDH基因（ncgl2578）对多种底物具有催化活性，包括对羟基苯甲醛，3,4-二羟基苯甲醛、邻苯二甲醛、丁香醛、苯甲醛，甚至CAD。鉴于各种芳香化合物的分解代谢依赖于vdh基因，vdh被认为是一种关键酶，参与利用木质素衍生的芳香化合物作为谷氨酸梭菌糖的替代碳源。37此外，关于其对原儿茶酸盐形成的重要贡献，可通过催化各种芳香化合物的醛形式转化为羧酸形式，将其吸收到TCA循环中，作者认为vdh基因是参与从CAD反向转化为t-CA的关键因素。因此，作者检测了谷氨酸梭菌中vdh基因的缺失，以防止CAD反向转化为t-CA。作者通过从MpV7-3菌株中删除vdh基因构建了MpV9-3菌株，然后分析了t-CA和CAD之间的生物转化性能。使用带有MpV7-3和MpV9-3的摇瓶培养物来分析反向转化曲线。当细胞达到固定相时，加入1.2 g\/L CAD。如下图B所示，添加到MpV7-3中的CAD继续减少，而t-CA逐渐增加。反应4小时后，培养物中残留0.28 g\/L的CAD，并产生约0.4 g\/L的t-CA。相比之下，在MpV9-3中，与MpV7-3相比，相同数量CAD的缩小宽度显著减小。此外，与MpV7-3不同，在MpV9-3中未观察到t-CA生成；这一结果表明，vdh的失活有助于抑制CAD向t-CA的反向转化。同时，作者发现增加的CAD逐渐减少，尽管没有观察到t-CA的反向转化。一个可能的原因可能是由于泄漏到CAL，而这并没有被未知的内源性还原酶和/或脱氢酶完全阻断，正如作者在早期与MpV7-3的转化反应中所示。

总之，作者描述了一种利用谷氨酸梭菌从t-CA生产CAD的高效生物转化工艺的开发。通过构建MpCAR基因的强大表达系统并补充NADPH，可以合成CAD，通过删除转化为CAL和反向转化为t-CA的途径，可以进一步提高CAD的转化率和转化率。据作者所知，这是谷氨酸梭菌CAD生产的首次报告，与微生物培养相比，作者的谷氨酸梭菌生物转化系统可以提供一个高度竞争和稳定的平台，微生物培养需要相对较长的培养时间（2天或更长），并且由于CAD毒性，细胞生长受到限制。如本文所示，通过微生物培养产生的粗t-CA可以直接供应，无需进一步分离，因此可以使用非常廉价的底物建立经济的生物处理平台。在此之前，作者还开发了一个谷氨酸梭菌生物转化平台，用于从L-苯丙氨酸生产t-CA。通过连接两个生物转化系统，可以建立从L-Phe到CAD的生物过程，作者相信这将对商业CAD生产做出重大贡献。

整理：张经纬

文章信息：

doi:10.1021/acs.jafc.1c07398

文章链接:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.1c07398.