紫外可见分光光度法的测定依据（紫外可见分光光度法分析条件的选择）

在分析工作中，为了使测量结果有较高的灵敏度和准确度，必须选择合适的实验条件，对分析条件进行优化。紫外-可见分光光度法的分析条件主要是指仪器测量条件、显色反应条件以及参比溶液的选择。

一、仪器测量条件的选择

1.测量波长 根据待测组分的吸收光谱，通常选择有最大吸收强度的吸收峰所对应的最大吸收波长λmax作为测量波长。因为在λmax处待测组分每单位浓度所改变的吸收光度最大，从而使得到的光谱具有很好的灵敏度；且在λmax处吸光度随波长的变化最小，从而使测量具有较高的准确度。但如果λmax处吸收峰太尖锐，则在满足分析灵敏度的前提下，选择次一级的吸收强度的吸收峰或肩峰对应波长作为测量波长。

2. 仪器狭缝宽度 狭缝的宽度直接影响测量的灵敏度和标准曲线的线性关系。狭缝宽度过宽时，通过样品溶液的光的强度增加，同时可能引入其他波长的单色光从而使测量的灵敏度降低，以致偏离朗伯-比尔定律。但若狭缝宽度过窄，光的强度变弱，测量的灵敏度也可能降低。通常在不减少吸光度时的最大狭缝宽度为适宜的狭缝宽。

3. 吸光度的范围 吸光度（A）在0.2~0.8时，实验偶然变动因素（光源的稳定性、测量环境改变等）对测量结果的影响较小，相对误差较小，所以在测量时，通常选择吸光度的测量范围在0.2~0.8。若超出该范围，可通过调整待测液的浓度和吸收池的厚度等方法进行调节。

二、显色条件的选择

分光光度法的许多分析都是建立在比色分析基础上的。如果待测组分本身没有颜色或本身颜色很浅，那么就无法直接进行测定，需利用显色反应将待测组分转变为有色物质，然后进行测定。这种将试样中待测组分转变成有色化合物的化学反应，称为显色反应。与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。在分光光度分析中，显色剂的选择及显色条件的控制极为重要。

（一）显色反应的要求

常用的显色反应是形成螯合物的反应，有时也采用形成简单配合物的反应和氧化还原反应。同一被测组分往往可与多种显色剂反应，生成不同有色物质，其原理和灵敏度亦有差别。在分析时，究竟选用何种显色反应较适宜，应考虑以下四个因素：

1. 显色反应灵敏度高 分光光度法一般用于微量组分的测定，要求显色剂与待测组分之间的显色反应具有很好的灵敏度，应选择显色反应产物的摩尔吸光系数ε较大的反应。

2.显色剂选择性好 显色剂只与待测组分发生显色反应，而与溶液中的共存组分不发生反应，这样仪器测量的数据才有很好的准确度。

3.显色剂的对照性要高 显色剂在测定波长处应无明显吸收，如果显色剂有色，则要求显色剂与显色反应产物的颜色差别要大，以减小试剂的空白值，提高测定的准确度。一般要求显色反应产物与显色剂的最大吸收波长之差应大于60nm。

4.显色反应产物稳定 要求待测组分与显色剂的反应产物有很好的稳定性，不易受空气、光等因素的影响。在测定过程中吸光度保持不变。

（二）显色条件的选择

1.显色剂用量 取决于形成有色化合物的组成。显色剂用量太少或太多均会引起对朗伯-比尔定律的偏离。为了保证显色反应尽可能完全，减少有色化合物的解离并使其保持恒定，一般需要加入适当过量的显色剂。显色剂的适宜用量可通过实验确定：在一系列相同待测组分溶液中加入不同浓度的显色剂，测定溶液的吸光度随显色剂的浓度变化曲线，在吸光度随显色剂浓度变化不大的范围内，确定显色剂的加入量。

2.溶液pH 多数显色剂是有机弱酸或弱碱，溶液的pH直接影响显色剂的解离程度，从而影响显色反应的完全程度。选择合适的pH是显色反应最基本的实验条件。溶液酸度对显色反应的影响是多方面的，如影响显色剂的平衡浓度和颜色变化、有机弱酸类的配位剂的存在形式、待测组分与配位剂形成的配合物的稳定性等。显色反应的最适宜酸度范围可以通过实验来确定：在待测组分浓度和显色剂浓度一定的情况下，测定吸光度随溶液pH变化曲线，吸光度恒定或变化较小时所对应的pH范围即为显色反应的最适宜的pH范围。

3.显色反应的时间和温度 有些显色反应瞬间完成，而且颜色稳定，在较长的时间内变化不大。但有些显色反应速度较慢，溶液颜色需要经过一段时间才能稳定，而且经过一段时间后，由于氧化、光照、试剂挥发等因素使颜色减退。实际工作中，确定适宜显色时间的方法是配制一份显色溶液，从加入显色剂开始，每隔一定时间测吸光度一次，绘制吸光度时间关系曲线。曲线平坦部分对应的时间就是测定吸光度的最适宜时间。显色反应通常在室温下进行，但对于反应速率较慢的反应体系，则需要改变反应条件，如对体系加热，从而加快反应速率。显色反应最适宜的温度也是通过实验确定的。

三、参比溶液

在吸光度测量中，先要用参比溶液调节透光率，设定通过参比溶液的透光率为100%，以消除吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。选择适宜的参比溶液对提高测定的准确度具有重要作用。如果参比溶液选择不当，常会引起校正曲线不过坐标原点或不成线性关系，因此分析测定时应视具体情况选择合适的参比溶液。

1.溶剂参比溶液 当样品组成较简单，共存的其他组分和显色剂在测定波长处无吸收时，可用纯溶剂（如蒸馏水）作为参比溶液，这样可消除吸收池、溶剂等因素的影响。

2.试剂参比溶液 如果显色剂在测定波长处有吸收时，则测量时应消除显色剂对测量的影响，此时应用空白溶液作为参比溶液，即按显色反应相同的条件，在溶剂中加入与样品溶液中相同含量的显色剂作为参比溶液。

3.样品参比溶液 如果样品溶液组分较复杂，其他共存离子在测定波长下有吸收但不与显色剂反应，当显色剂无吸收时，可用不加显色剂的被测试样溶液作为参比溶液。

4.平行操作参比溶液 若显色剂、待测溶液中各组分均在测定波长下有吸收，则可用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样同时进行处理，测定时以前者所得的溶液为参比溶液，称为平行操作参比溶液。临床上进行某种血药浓度的监测时，可取正常人血样和待测血药浓度的血样在相同条件下处理，用正常人血样得到的溶液作为参比溶液。