高锰酸钾与草酸反应的方程的讲解（热休克蛋白90及其四个结构域）

Yoodee S, Peerapen P, Plumworasawat S, Thongboonkerd V. Roles of heat-shock protein 90 and its four domains (N, LR, M and C) in calcium oxalate stone-forming processes. Cell Mol Life Sci. 2022 Jul 28;79(8):454. doi: 10.1007/s00018-022-04483-z. PMID: 35900595; PMCID: PMC9330963.

热休克蛋白90及其四个结构域（N，LR，M和C）在草酸钙结石形成过程中的作用

人热休克蛋白90（HSP90）有四个功能域，包括NH2-终端 （N）、带电链接器区域 （LR）、中间 （M） 和 COOH 终端 （C） 域。在肾结石病（或肾结石/尿石症）中，HSP90是草酸钙一水合物（COM）的受体，草酸钙是形成肾结石的最常见晶体。然而，HSP90及其四个结构域在肾结石形成中的作用仍不清楚且研究不足。因此，我们检查并比较了它们在肾结石形成的物理（结晶，生长和聚集）和生物学（晶体细胞粘附和通过细胞外基质（ECM）的晶体侵袭）致病过程中对COM晶体的影响。分析表明，全长（FL）HSP90在结晶过程中明显增加了COM晶体的尺寸和丰度，并显着促进了晶体的生长、聚集、粘附在肾细胞上和ECM侵袭。在4个单独结构域中，N和C结构域的促进作用最强，而LR结构域对COM晶体的促进作用最弱。综上所述，我们的研究结果表明，FL-HSP90及其四个结构域（N，LR，M和C）促进COM结晶，晶体生长，聚集，粘附在肾细胞上并通过ECM侵入，所有这些都是肾结石形成的重要物理和生物致病过程。

肾结石病是一种常见的肾脏疾病，是由肾脏内矿物盐形成的固体晶体的发育和沉积引起的[1]。在各种形式的晶体中，草酸钙一水合物（COM）最常在结石成型剂（患者）中观察到[2]。由于肾结石病的发病率和患病率逐年增加[3-5]，因此进行了广泛的研究，以获得必要的信息，以彻底了解结石的发病机制及其形成机制。最近，蛋白质组学已被应用于解开结石形成过程并鉴定结石调节剂。已经从结石形成物[6]和肾结石基质的尿液中鉴定出一千多种蛋白质[7]。此外，已通过蛋白质组学方法鉴定出COM晶体对肾小管上皮细胞（RETEC）中蛋白质表达的改变[8-17]。有趣的是，功能分析表明，一些这种改变的蛋白质在结石过程中起调节剂（启动子或抑制剂）[18，19]和COM晶体受体[20-22]的作用。

热休克蛋白90（HSP90）是一种伴侣，在调节各种细胞过程中发挥作用，包括细胞周期[23]、细胞增殖[24]、信号通路[25]和蛋白稳态（蛋白质稳态）[26]。在人类中，HSP90α是HSP90在细胞质中的主要亚型，在应激条件下高度表达[27]。HSP90有四个域，这些域对其功能至关重要[28]。新罕布什尔州2末端 （N） 域对于 ATP 结合 [29] 和共同伴侣识别 [30] 是必需的。中（M）结构域已被建议参与ATP水解[31]和HSP90-客户端和HSP90-共同伴侣相互作用[32]。带电链接器区域（LR）域是N域和M域之间的灵活连接器，在调节N域和M域的排列以进行客户端绑定方面发挥着重要作用[33]。COOH末端（C）结构域对于HSP90二聚化[34]和HSP90-伴随相互作用至关重要[35]。作为应激诱导的蛋白质之一，HSP90与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病[36]，硬化症[37]，癌症[38]和人类冠状病毒感染[39]。

最近已经探索了HSP90在肾结石疾病中的作用。先前的研究表明，在RTEC的顶膜上表达的HSP90可能是COM晶体受体之一[8]。随后，其COM晶体结合能力已使用COM晶体 - 细胞粘附测定法进行了功能验证[21，22]。此外，已观察到HSP90与其他潜在的COM晶体受体形成复合物，包括α-微管蛋白、β-肌动蛋白和维门汀[22]。这些数据表明，HSP90作为COM晶体受体，也是其他几种COM晶体结合蛋白的相互作用伙伴。然而，HSP90及其四个域（N，LR，M和C）在COM晶体调制和肾结石形成过程中的作用仍不清楚且研究不足。因此，本研究检查并比较了它们在肾结石形成的物理（结晶，生长和聚集）和生物学（晶体 - 细胞粘附和通过细胞外基质（ECM）的晶体侵入）致病过程中对COM晶体的影响。

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材料和方法

人类 HSP90 结构

其全长（FL）和N，LR，M和C域的5个HSP90结构是使用先前发布的协议生成的[40]。简而言之，编码FL人HSP90及其四个结构域的cDNA使用聚合酶链反应（PCR）单独扩增。通过将每个cDNA模板与Q5高保真DNA聚合酶混合来制备PCR（新英格兰生物实验室;马萨诸塞州贝弗利）和特异性引物对（表1).对于克隆，NotI的限制性位点被掺入正向和反向引物中。PCR在98°C下进行初始变性3分钟，然后在98°C下进行35个循环变性30 s，在55°C下退火30 s并在72°C下延伸2分钟。最后的延伸步骤在72°C下完成10分钟。

表 1所有用于构建全长HSP90及其四个结构域的引物

底漆	核苷酸序列 （5'–3'）一个
全长 （FL） 结构
前锋	关贸总协定
FL-反向	关贸总协定
新罕布什尔州2-终端 （N） 域构造
N-前锋	关贸总协定
N-反向	关贸总协定
带电链接器区域 （LR） 域构造
LR-前进	关贸总协定
反光	关贸总协定
中间 （M） 域构造
M-前锋	关贸总协定
M-反向	关贸总协定
库欧终端 （C） 域构造
C-前锋	关贸总协定
C 型反向	关贸总协定

a带下划线的序列是 NoltI限制性位点

扩增后，所有PCR产物均用NotI限制性内切酶（新英格兰生物实验室）克隆成细菌表达载体pET-32b（ ）（新星，默克KGaA;达姆施塔特，德国）。携带单个HSP90构建体的载体使用热休克法分别转化为10-β胜任的大肠杆菌（新英格兰生物实验室）。选择阳性菌落并使用菌落PCR检查是否存在插入片段。最后，使用GF-质粒DNA提取试剂盒分离含有插入片段的质粒载体（Vivantis;雪兰莪州，马来西亚），通过DNA测序验证了插入片段的核苷酸序列和取向。

重组HSP90构建体的制备

为了表达重组蛋白，使用热休克方法将携带单个HSP90构建体的载体引入BL21（DE3）主管大肠杆菌（Novagen）中。在18°C下与异丙基-β-D-硫代糖醛糖苷（IPTG）孵育16小时后，将细菌培养物在5，000×g和4°C下离心10分钟以沉淀细胞。通过裂解/结合缓冲液（25 mM Tris，500 mM NaCl，5%甘油;pH 7.5）提取细胞蛋白。在12，000×g和4°C下离心20分钟以沉淀细胞碎片，然后收集包括重组蛋白在内的所有细胞蛋白。

pET-32b（ ）载体产生的重组HSP90构建体与硫氧还氧还蛋白、六组氨酸和S蛋白标签（Trx-His-S）融合。蛋白质裂解物中的这些融合重组蛋白是使用Ni-NTA His·结合树脂珠（新星）。将裂解物与500μl珠子在4°C下在管旋转器上孵育1小时。将混合物轻轻加入柱中，然后用洗涤缓冲液（用10mM咪唑裂解/结合缓冲液）洗涤。此后，通过在柱的中心加入2.5ml洗脱缓冲液（与250mM咪唑的裂解/结合缓冲液）从柱中洗脱标记的蛋白质。

与纯化的重组HSP90构建体融合的Trx-His-S标签通过在特定消化条件下与重组肠激酶（EK）孵育而除去，如表所示2.在25°C下消化16小时后，采用琼脂糖（新星）除去EK和Ni-NTA His·结合树脂珠（Novagen）用于捕获切割的融合标签蛋白和未清除的重组蛋白。经过短暂的离心沉淀珠子，收集上清液中纯化的重组HSP90蛋白。使用生物雷达蛋白质测定法测量单个样品中的蛋白质浓度（生物雷达实验室;赫拉克勒斯，加利福尼亚州）。最后，调整所有样品的摩尔浓度以使其相同。

表 2 标记的 HSP90 构造的切除条件

高速钢90结构	肠激酶 （U）	尿素（M）
佛罗里达州	0.5	1
N	0.5	2
断续器	1.0	–
M	0.5	1
C	0.5	1

COM 结晶化测定

结晶测定是使用先前发表的方案进行的[41，42]。最初，氯化钙（氯化钙2·2H2O） （默克;新泽西州布兰奇堡）（10 mM）和草酸钠（Na2C2O4）（密苏里州圣路易斯西格玛-奥尔德里奇）（在1mM处）溶液在含有10mM Tris的结晶缓冲液（pH 7.4）中制备（Affymetrix公司;俄亥俄州克利夫兰）和90 mM氯化钠（NaCl）（生物碱性;加拿大多伦多）。在24孔板的每个孔中（康宁公司;康宁，纽约州），500微升10 mM钙氯化钾2·2H2加入O，然后加入7μl每个纯化的重组HSP90结构（FL，N，LR，M或C）（其最终摩尔浓度等于45nM。）。同时，加入等体积的结晶缓冲液而不使用任何蛋白质的孔作为空白对照，而那些添加相同体积和摩尔浓度的溶菌酶（Sigma-Aldrich）的孔作为阴性对照。然后，500微升1 mM钠2C2O4被添加到每个孔中。将混合物在25°C下孵育1小时。此后，使用尼康日食Ti-S倒置相差光学显微镜观察和成像COM晶体（尼康;日本东京）。在每个实验中，使用NIS Element D软件版本4.11（尼康）从每个样品15个随机场中的至少100个晶体中测量晶体尺寸。然后使用以下公式计算晶体丰度：

傅里叶变换红外 （FT-IR） 光谱

如前所述，进行了FT-IR光谱分析以确认晶体类型（COM）[43]。简而言之，晶体在配备衰减全反射（ATR）附件的Nicolet 6700 FT-IR光谱仪和OMMC软件版本8.3（赛默飞世尔科技有限公司;马萨诸塞州沃尔瑟姆）。从4000到600厘米采集样品光谱−1分辨率为 4 cm 的范围−1每个频谱。然后使用OMMC软件将所有这些样品光谱与参考FT-IR肾结石基本库进行匹配。

COM 晶体生长测定

晶体生长测定使用先前发表的方案进行[44，45]。最初，500微升10 mM氯化钙2·2H2将O加入24孔板的每个孔中，然后加入500μl1 mM Na2C2O4.将混合物在25°C下孵育1小时以允许结晶完成。此后，将7μl每个纯化的重组HSP90构建体（FL，N，LR，M或C）或溶菌酶（阴性对照）以相等的摩尔浓度（最终45nM）或结晶缓冲液（无蛋白质（空白对照）加入到每个孔中。此时（T0），使用尼康日食Ti-S倒置相差光学显微镜拍摄晶体图像。将混合物在25°C下进一步孵育60分钟（T60），晶体图像再次在T处拍摄60.在每个实验中，使用NIS Element D软件版本4.11，从每个样品15个随机场中的至少100个晶体中测量晶体尺寸。Δ 表示晶体生长的晶体尺寸，然后使用公式计算：

除了图像分析外，还使用BD Accuri C6流式细胞仪（BD生物科学;加利福尼亚州圣何塞）。在 T0和 T60，前向散射（FSC），通常是指颗粒尺寸，在每个实验中从每个样品的10，000个晶体中测量。Δ 表示晶体生长的晶体尺寸，然后使用以下公式计算：

COM 晶体聚集测定

通过混合1：1（体积/体积）的10 mM CaCl，以更大的比例产生COM晶体2·2H2O 和 1 毫摩尔纳2C2O4并在25°C下孵育过夜[46，47]。在2，000×g和25°C下离心5分钟以收获晶体。用甲醇洗涤三次后，使晶体风干。然后使用先前发表的方案进行晶体聚集测定[48，49]。在每个孔中，将1，000μg干燥的COM晶体重新悬浮在1ml结晶缓冲液中。随后，将7μl每个纯化的重组HSP90构建体（FL，N，LR，M或C）或溶菌酶（阴性对照）以相等的摩尔浓度（最终45nM）或结晶缓冲液（空白对照）加入到每个孔中。将混合物在热混合器C中孵育（埃彭多夫;纽约州哈帕克）在150rpm和25°C下振荡1小时。此后，使用尼康日食Ti-S倒置相差光学显微镜拍摄晶体图像。晶体聚集体的数量，通过“紧密连接在一起的三个或更多单个COM晶体的组装”[48]来表征，在每个实验中从每个样本的至少15个随机场中计数。除图像分析外，还使用BD Accuri C6流式细胞仪（BD生物科学）通过流式细胞术对晶体聚集进行定量。晶体聚集体的百分比，其特征在于FSC的右移和侧散射（SSC）从单个晶体的一般群体向上移动，然后使用以下公式从每个样品的10，000次测量中计算：

COM 晶体-细胞粘附测定

晶体-细胞粘附测定是使用先前发表的方案进行的[50，51]。马德克（亚检中心;Manassas，VA）是一种远端肾小管上皮细胞系，被用作该测定的细胞模型。细胞在完整的培养基中繁殖，含有杜尔贝茨科的修饰鹰培养基（DMEM）（Gibco;纽约州格兰德岛）补充了10%热灭活胎牛血清（FBS）（Gibco），60 U / ml青霉素G（西格玛 - 奥尔德里奇）和60μg/ ml链霉素（西格玛 - 奥尔德里奇）。将细胞维持在含有5%CO的加湿培养箱中2在37°C。约5× 105将细胞接种到6孔板（康宁公司）的每个孔中。然后将细胞在37°C的加湿培养箱中与5%CO的加湿培养箱中生长2持续24小时或直到它们汇合。同时，在聚集测定中如上所述制备COM晶体。将干燥的COM晶体暴露在紫外线-C光下30分钟以消除任何微生物污染。然后将去污的晶体（100μg）重新悬浮在1ml完全培养基中。随后，将7μl每个纯化的重组HSP90构建体（FL，N，LR，M或C）或溶菌酶（阴性对照）以相等的摩尔浓度（最终45nM）或没有蛋白质的结晶缓冲液（空白对照）加入到晶体悬浮液中。汇合后，取出培养基，将晶体悬浮液加入到汇合的细胞单层上，并进一步孵育在具有5%CO的加湿培养箱中2在37°C下持续1小时。此后，通过用PBS剧烈洗涤从细胞中除去未结合的晶体。然后使用尼康Eclipse Ti-S倒置相差光学显微镜对粘附在细胞单层上的其余晶体进行成像。在每个实验中，从每个样品的至少15个随机场中计算粘附晶体的数量。

晶体侵入（通过 ECM）检测

晶体入侵试验是使用先前发表的方案进行的[52，53]。将干燥的COM晶体（20μg）（与聚集测定一样制备）重新悬浮在200μlDMEM中。随后，将7μl每个纯化的重组HSP90构建体（FL，N，LR，M或C）或溶菌酶（阴性对照）以相等的摩尔浓度（最终45nM）或没有蛋白质的结晶缓冲液（空白对照）加入到晶体悬浮液中。将混合物在4°C的管旋转器上孵育过夜，以使蛋白质完全结合到晶体表面上。此后，通过在2，000×g和4°C下离心5分钟来除去未结合的晶体。用PBS洗涤和另一个离心循环后，将晶体 - 蛋白质复合物与200μl0.3 pM Lys-纤溶酶原一起孵育（菲茨杰拉德工业国际;阿克顿，马萨诸塞州）在PBS在37°C下1小时。通过在2，000×g和4°C下离心5分钟，然后用PBS洗涤和另一个离心循环来除去未结合的纤溶酶原。然后将晶体 - 蛋白质 - 纤溶酶原复合物与PBS中的100μl0.15 pM尿激酶纤溶酶原激活剂（菲茨杰拉德工业国际）混合。最后，将混合物轻轻地加入含有基质凝胶的ECM迁移室的顶部，并在37°C下进一步孵育24小时。通过使用具有微分干涉对比度（DIC）模式的光学显微镜（尼康Eclipse 80i）对ECM腔室内晶体的入侵进行成像。在每次实验中，使用NIS Element D软件4.11版本，从每个样品的5个随机场（每个样品100次测量）的至少20个区域测量单个样品中晶体的侵入距离。

FL-HSP90表面静电势分布及其四个域的分析

采用UCSF ChimeraX软件（1.3版）（https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax）分析了FL-HSP90表面的静电势分布及其4个结构域，采用ΑFold蛋白质结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk）中的HSP90三维结构作为模板。然后根据库仑定律自动计算FL-HSP90及其四个域的静电势。

统计分析

定量数据来自不同生物重复的三个独立实验，并在所有实验中表示为均±SEM。卫生和计算机辅助系统软件（版本 18）（IBM SPS;纽约州阿蒙克）用于统计分析。使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫和夏皮罗-威尔克检验检查每个数据集的正态分布。当数据呈正态分布时，使用单向方差分析（ANOVA）与Tukey的事后检验进行了多次比较，但对没有正态分布的那些使用Kruskal-Wallis检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

生产重组阻燃、氮、低分子、中链和 C-HSP90 蛋白

为了研究FL-HSP90及其四个结构域（N，LR，M和C）在COM晶体调制和肾结石形成过程中的作用，根据先前建立的协议构建了重组FL-HSP90及其四个结构域[40]。如图所示。1FL-HSP90由732个氨基酸残基组成，而N、LR、M和C结构域分别包含236个（第1-236个）、35个（第237-271个）、357个（第272-628个）和104个（第629-732个）残基。通过计算pI/ Mw工具（https://web.expasy.org/compute_pI/）计算它们的等电点（pI）表明FL-HSP90表现出带负电荷的性质，酸性pI为4.94。对于其结构域，N，LR和C也显示出带负的性质，pI分别为4.63，4.16和4.34。另一方面，M域显示带正电荷的值，pI为8.42（图1.42）。1).

图 1

人HSP90及其四个结构域的位置和氨基酸序列。单个 HSP90 结构，包括全长 （FL），新罕布什尔州2终端域 （N）、带电荷的类似域域 （LR）、中间域 （M） 和 COOH 终端域 （C） 是使用先前发布的协议设计的 [40]。每个HSP90结构的位置，氨基酸序列和理论等电点（pI）在单独的框中给出。这些结构的其他参数详见表格1和2

氟、氮、低分子、中、氨基和C-HSP90对COM结晶的影响

所有具有相同体积和摩尔浓度的重组HSP90结构体均进行COM结晶测定（图。2A）.不含蛋白质的等体积结晶缓冲液作为空白对照，而具有相同体积和摩尔浓度的溶菌酶作为阴性对照。孵育1小时后，使用F1测量晶体尺寸并计算晶体丰度。与空白和阴性对照相比，FL-HSP90和所有其他HSP90结构显着增加了晶体尺寸和丰度（图1）。2B 和 C）。比较这4个结构域，C-HSP90对晶体尺寸和丰度的促进作用最强，而LR-HSP90对晶体尺寸和丰度的促进作用最弱（图.2B 和 C）。

图 2

氟、氮、低分子、中、中、碳氢化合物90对COM结晶的影响.结晶测定在没有（空白对照）或存在每个HSP90构建体或溶菌酶（阴性对照）的情况下以相等的摩尔浓度（45nM）进行。通过使用倒置相差光学显微镜捕获COM晶体的显微照片。在每个实验中，从每个样品15个随机场中的至少100个晶体中测量B晶体尺寸。C晶体丰度来自每个使用F1的实验中每个样品的至少15个随机场（参见“材料和方法”）。所有定量数据均来自使用不同生物学重复的三个独立实验，并以平均±SEM表示 <。# =p< 0.05 与 FL;δ=p< 0.05 对 N;† =p< 0.05 与 LR

傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析晶体类型

为了确认我们的结晶测定产生典型的COM晶体，通过FT-IR光谱分析所得晶体的化学成分。数据证实，所有样品光谱均与FT-IR肾结石基本库中的参考COM光谱一致匹配（补充图。S1）。

氟、氮、反、中、中、聚碳醚对COM晶体生长的影响

晶体生长测定的进行类似于结晶测定，但在初始结晶60分钟后开始，以使结晶完成（以避免新结晶的影响）。监测结晶和晶体生长阶段显示，自氯化钙与草酸钠混合后的最初几分钟起，直到40分钟，当晶体数量稳定时，新晶体连续发生（补充图.S2）。此后，晶体生长（如晶体尺寸增加所示）持续到监测结束120分钟（补充图。S2）。

初始结晶步骤后1h，无需蛋白质干预（T0）（或在补充图中所示的60分钟时间点。S2），将预制好的晶体与每种重组HSP90构建体，溶菌酶（阴性对照）或结晶缓冲液一起进一步孵育，无蛋白质（空白对照），体积相等和/或摩尔浓度相等60分钟（T60）（或在120分钟的时间点，如补充图所示。S2）。晶体图像分析显示，FL-HSP90显着促进了预制晶体的生长或扩大，与空白和负对照相比，Δ晶体尺寸显着增加（图1）。3).在4个结构域中，N-HSP90对COM晶体生长的促进作用最强，而LR-HSP90对COM晶体生长的影响最弱（图.3).

图 3

通过图像分析，氟、N、LR、M和C-HSP90对COM晶体生长的影响.在没有（空白对照）或存在每种HSP90结构或溶菌酶（阴性对照）的情况下，以相等的摩尔浓度（45nM）进行晶体生长测定。在T处捕获了COM晶体的显微照片0和 T60通过使用倒置相差光学显微镜。断续器T 时的晶体尺寸0和 T60在每个实验中，从每个样品的15个随机场中的至少100个晶体中测量。I：然后使用公式2计算代表晶体生长的Δ晶体尺寸（参见“材料和方法”）。所有定量数据均来自使用不同生物学重复的三个独立实验，并以平均±SEM表示 <。# =p< 0.05 与 FL

除图像分析外，还通过流式细胞术评估COM晶体生长。与图像分析一致，流式细胞术分析显示，与空白和阴性对照相比，FL-HSP90显着促进了COM晶体生长（Δ晶体尺寸）（图1.22）。4).在4个结构域中，N-和C-HSP90对COM晶体生长的促进作用最强，而LR-HSP90对COM晶体生长的促进作用最弱（图.4).

图 4

流式细胞术对COM晶体生长的影响，N，LR，M-和C-HSP90。在没有（空白对照）或存在每种HSP90结构或溶菌酶（阴性对照）的情况下，以相等的摩尔浓度（45nM）进行晶体生长测定。散点图显示每个样品在T下每个实验中 10，000 个 COM 晶体的大小（由前向散射或 FSC 指示）和0 T60由BD安科瑞C6流式细胞仪测量。然后使用式3计算代表晶体生长的B Δ晶体尺寸（参见“材料和方法”）。所有定量数据均来自使用不同生物学重复的三个独立实验，并表示为均值±SEM。皮肤接触 = 侧向散射;* =p< 0.05 与空白和阴性对照;# =p< 0.05 与 FL;δ=p< 0.05 与 N;† =p< 0.05 与 LR;$ =p< 0.05 与 M

氟、北、反、中、南、三硫化弹性体对COM晶体聚集的影响

晶体聚集体（或“紧密连接在一起的三个或多个单个COM晶体的组装”[48]）的数量在与每个重组HSP90结构，溶菌酶（阴性对照）或结晶缓冲液（空白对照）孵育1小时后计数，具有相等的体积和/或相等的摩尔浓度。如图所示。5与空白和负对照相比，所有5个HSP90结构的晶体聚集体数量明显增加。在4个结构域中比较，N-和C-HSP90对COM晶体聚集的促进作用最强，而LR-HSP90对COM晶体聚集的促进作用最弱（图.5).

图 5

通过图像分析，FL-，N-，LR-，M-和C-HSP90对COM晶体聚集的影响.在没有（空白对照）或存在每个HSP90构建体或溶菌酶（阴性对照）的情况下，以相等的摩尔浓度（45nM）进行晶体聚集测定。使用倒置相差光学显微镜捕获了COM晶体聚集体的显微照片（用虚线圆圈突出显示）。B通过“紧密连接在一起的三个或更多个单独COM晶体的组装”[48]来表征的晶体聚集体的数量，在每个实验中从每个样本的至少15个随机场中计数。所有定量数据均来自使用不同生物学重复的三个独立实验，并以平均±SEM表示 <。# =p< 0.05 与 FL

除图像分析外，还通过流式细胞术评估COM晶体聚集。与图像分析一致，流式细胞术分析显示，与空白和阴性对照相比，所有5个HSP90构建体均明显促进了COM晶体聚集（图1.22）。6).在4个结构域中，N-和C-HSP90对COM晶体聚集的促进作用最强，而LR-HSP90对COM晶体聚集的促进作用最弱（图.6).

图 6

流式细胞术对COM晶体聚集的影响在没有（空白对照）或存在每个HSP90构建体或溶菌酶（阴性对照）的情况下，以相等的摩尔浓度（45nM）进行晶体聚集测定。使用BD Accuri C6流式细胞仪，从每个样品的10，000次测量中获得晶体聚集体的散点图，其特征在于右移前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的向上偏移（SSC）（用虚线矩形突出显示）。B使用式4计算晶体聚集体的百分比（参见“材料和方法”）。所有定量数据均来自不同生物重复的三个独立实验，并以均值±SEM表示 <。# =p< 0.05 与 FL;δ=p< 0.05 对 N;† =p< 0.05 与 LR

氟、氮、反、中、南、三元对连续输卵管粘附的影响

在MDCK细胞单层与COM晶体和每个重组HSP90构建体的混合物，溶菌酶（阴性对照）或结晶缓冲液（空白对照）的混合物孵育1小时后，评估粘附的晶体，具有相等的体积和/或相等的摩尔浓度，然后进行剧烈洗涤。数据表明，所有五种HSP90结构都明显增加了电池单层上粘附的COM晶体的数量（图1）。7).在4个结构域中，尽管LR-HSP90的促进作用最弱，但它们对COM晶体 - 细胞粘附的促进作用程度相当（图。7).

图 7

氟、氮、反、中、中、合和C-HSP90对COM晶体-细胞粘附的影响.在没有（空白对照）或存在每个HSP90构建体或溶菌酶（阴性对照）的情况下，以相等的摩尔浓度（45nM）进行晶体 - 细胞粘附测定。使用倒置相差光学显微镜在剧烈洗涤后，粘附的COM晶体的显微照片保留在细胞单层上。B在每个实验中，从每个样品至少15个随机场中计数粘附的COM晶体的数量。所有定量数据均来自不同生物学重复的三个独立实验，并以均值±SEM表示 <。

氟、氮、低分子、中、南、恒氧化硫对心电图细胞增殖干细胞侵入COM晶体的影响

使用含有基质凝胶的迁移室来模拟肾间质内部事件，研究了FL-HSP90及其4个结构域通过ECM侵入COM晶体的影响。在ECM室中将晶体 - 蛋白质 - 纤溶酶原复合物与尿激酶纤溶酶原激活剂孵育24小时后测量晶体入侵距离。结果表明，与空白对照和负对照相比，5种HSP90结构均对通过ECM侵入COM晶体表现出有效的促进作用（图.8).与4个结构域相比，N-HSP90对通过ECM侵入COM晶体的促进作用最强，而M-HSP90对COM晶体通过ECM的侵入表现出最弱的促进作用（图.8).

图 8

氟、N、LR、M-和 C-HSP90 对通过心电图细胞机制侵入 COM 晶体的影响.在没有（空白对照）或存在每个HSP90构建体或溶菌酶（阴性对照）的情况下，以相等的摩尔浓度（45nM）进行晶体入侵（通过ECM）测定。使用具有微分干涉对比度（DIC）模式的光学显微镜捕获了入侵的COM晶体的显微照片。B在每个实验中，从每个样品的5个随机场（100个测量/样品）中的至少20个区域测量单个样品中晶体的入侵距离（d）。所有定量数据均来自使用不同生物学重复的三个独立实验，并以平均±SEM表示 <。# =p< 0.05 与 FL;δ =p< 0.05 与 N;† =p< 0.05 与 LR;$ =p< 0.05 与 M

钙的分析2 - 和 C2O42−-FL-HSP90及其四个域中的绑定基序

为了确定FL-HSP90及其四个结构域（N，LR，M和C）对COM晶体的促进作用机制，分析了其序列中的电位Ca2 - 和 C2O42−-绑定图案。结果表明，FL-HSP90及其所有四个结构域均不含任何Ca2 -绑定图案/图案。但是，有五个潜在的C2O42−-结合位点仅在M-HSP90中发现（在残基340-348，363-370，382-389，394-403和409-416）中，而在其他HSP90结构域中未检测到（图。9).

图 9

潜在 C2O42−-在人类 HSP90 中绑定图案。FL-HSP90和N，LR，M和C域的序列被提交给扫描候选工具（https://prosite.expasy.org/scanprosite/）以搜索C2O42−先前报道的结合模式“L-x（3，5）-R-x（2）-[AGILPV]”[54]。该模型由UCSF ChimeraX软件（1.3版）（https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax）使用αFold蛋白质结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk）中提供的HSP90的3D结构作为模板构建。五大潜力C2O42−结合位点（第340-348、363-370、382-389、394-403和409-416残基处的蓝色）仅在M域（橙色）中发现，而在其他HSP90域中未检测到（灰色）

FL-HSP90表面静电势分布及其四个域的分析

为了进一步探讨FL-HSP90及其四个结构域（N，LR，M和C）对COM晶体的促进作用的机制，还分析了它们表面的静电势分布。使用UCSF ChimeraX软件（版本1.3）的分析显示，它们的平均静电势在弱到中度负的范围内（− 3.47， − 3.31， − 7.40， − 0.55 和 − 4.22 千卡/（摩尔·e） 分别用于氟、北、低、中、中和三硫化弹性体90（表）3和图。10).

表 3 FL-HSP90 表面的静电势及其四个域

高速钢90结构式	静电势（千卡/摩尔·四))
	最低	最大	意味 着
佛罗里达州	− 22.89	10.55	− 3.47
N	− 21.93	10.44	− 3.31
断续器	− 18.12	5.40	− 7.40
M	− 13.55	14.79	− 0.55
C	− 16.39	8.26	− 4.22

图 10 FL-HSP90及其四个域表面的静电势分布。这些模型由UCSF ChimeraX软件（版本1.3）（https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax）使用αFold蛋白质结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk）中提供的HSP90的3D结构作为模板构建。FL-HSP90及其四个域的静电势是根据库仑定律自动计算的。红色表示带负电荷，而蓝色表示带正电荷的分布，范围为 − 25 至 25 kcal/（mol·e）. 其他详细信息在表中报告3

讨论

几十年来，蛋白质在肾结石疾病中的作用已被广泛研究。蛋白质组学研究最近表明，COM晶体可以改变参与细胞过程和组分的几种蛋白质的表达[9]。此外，几种不同的蛋白质与COM晶体结合[50]并掺入结石基质中，这可以通过它们在肾结石内的鉴定来证明[7]。重要的是，这些蛋白质已被建议在结石形成过程中充当启动子或抑制剂[55，56]。实验研究表明，蛋白质的粘附和掺入晶体对结石形成的几个步骤有重要影响[18-20]。

最近，HSP90被表征为COM晶体受体之一[21]。此外，据报道，它与其他COM晶体受体相互作用[22]。因此，我们假设HSP90可以结合或掺入COM晶体中，然后调节结石形成过程。因此，我们进行了研究，以确定FL-HSP90及其四个结构域对COM结晶，生长，聚集，粘附和通过ECM侵入的影响。

结晶是当肾小管液或间质液与结石形成矿物（主要是钙）过饱和时发生的初始过程2 和 C2O42−离子 [57].。除了高浓度的矿物质外，过饱和流体还富含几种调节晶体形成的大分子[56]。结晶过程可以通过使用几个参数来评估，包括晶体数量，大小和晶体质量[49]。在这里，我们通过测量晶体尺寸和计算晶体丰度来评估COM结晶。我们的COM结晶测定表明，FL-HSP90及其四个结构域促进了COM结晶，但程度不同。

蛋白质 - 晶体相互作用由多种因素驱动，其中之一是蛋白质的净静电荷[58]。基于质谱和生物信息学分析的研究表明，大多数已鉴定的COM结合蛋白表现出带负或正电荷的特性[50]。这些电荷取决于氨基酸的含量，特别是决定单个残基的酸性（天冬氨酸和谷氨酸）或碱性（赖氨酸和精氨酸）性质的侧链[59]。有趣的是，从石基质中鉴定出的大多数蛋白质表现出低于5或高于9的等电点（pI）[59]。决定蛋白质-晶体相互作用的另一个因素是钙结合位点的存在（Ca2 ） 和草酸盐 （C2O42−蛋白质分子中的离子。在参与肾结石形成的蛋白质中已经观察到这些结合位点，例如Tamm-Horsfall蛋白（THP）[60]和纤连蛋白[18]。

迄今为止，加利福尼亚州2 - 和 C2O42−HSP90的结合位点尚未报道。在我们目前的研究中，分析Ca2 - 和 C2O42−-绑定图案，没有一个 Ca2 -在FL-HSP90及其所有四个域中发现的绑定基序。同样，没有一个C2O42−在 N-、LR-和 C-HSP90 中发现了结合基序。然而，M-HSP90包含五个潜在的C2O42−-结合位点。有趣的是，FL-、N-、LR-和C-HSP90在酸性pI下表现出带负电的性质， 而其M结构域在碱性pI下表现出带正电的值.它的正电荷也可能是C的原因2O42−与五个潜在C的绑定2O42−-结合位点。虽然FL-HSP90和其他域没有显示任何Ca2 - 和 C2O42−-结合基序，它们的弱到中度负静电势可能是导致Ca的原因2 -独立于已知或公认的 Ca 的绑定2 -结合基序，从而促进COM结晶、晶体生长和聚集。尽管如此，这一假设仍有待阐明。

COM晶体形成后，通过添加游离Ca，它们可以在过饱和条件下连续生长2 和 C2O42−离子到晶体[61]。免疫荧光染色揭示了晶体生长过程中带负电荷的蛋白质在晶体内外的空间分布[19]。在目前的研究中，带负电荷的FL-HSP90、N-HSP90和C-HSP90以及带正电荷的M-HSP90可以促进COM晶体的生长。这一发现与最近一项研究的报道一致，该研究表明，从大肠杆菌中分离出的鞭毛由于其电荷而对晶体生长表现出促进作用[45]。可能，可以解释涂覆在晶体表面上的带负电荷和带正电荷的蛋白质可以与游离的Ca结合2 和牛2−，分别导致晶体生长[62]。

晶体聚集通过将几个晶体连接在一起以扩大尺寸并形成晶体团聚[63]来进行。大的晶体聚集体会粘附在肾小管上皮细胞表面，从而阻碍肾小管内液体流动[64]。晶体聚集的促进和抑制也受涂覆在COM晶体表面的蛋白质的静电荷量程度的调节[58，65]。由于带弱电荷的蛋白质的结合亲和力低，晶体表面上的剩余区域可以与其他晶体表面上的蛋白质结合（蛋白质 - 晶体 - 蛋白质相互作用）[65]。相比之下，带强电荷的蛋白质可以完全粘附在晶体表面上并阻断晶体 - 晶体组合[65]。研究表明，弱至中度静电带电的FL-HSP90及其四个结构域对COM晶体聚集表现出促进作用。这一发现与另一项研究一致，该研究显示弱至中度静电带电的纤连蛋白（由UCSF ChimeraX（版本1.3）计算的平均静电电位为−3.78千卡/（mol·e））具有促进晶体聚集的潜力[18]。

结石形成的另一个重要致病过程是晶体粘附在RTEC上[16]。除了在顶端质膜上表达的COM晶体受体外，晶体细胞粘附还可以通过尿液[18]和分泌的蛋白质[66]来调节。在这项研究中，我们发现FL-HSP90及其四个结构域可以增加晶体与MDCK细胞的结合，表明它们作为晶体 - 细胞粘附的促进剂起作用。在一致性中，在晶体诱导的ER应力期间从RETEC分泌的蛋白质可以通过增加晶体 - 细胞粘附来影响结石的形成[66]。有两种可能性可以解释这一观察结果。一个是静电荷。用带正电荷或带负电荷的分子涂覆晶体表面可能会改变其静电电荷，并随后影响晶体的粘合能力[57]。另一个因素是蛋白质 - 蛋白质相互作用。这种促进作用可以通过涂覆在晶体表面的HSP90分子与位于RTEC表面的其他COM晶体受体之间的相互作用来调节[22]。

晶体 - 细胞相互作用也可能导致晶体从管状管腔易位到管状上皮细胞[43，67，68]。此后，晶体可能通过纤溶酶-纤溶酶原途径迁移或侵入肾间质[53]。有证据表明，包被在晶体表面的蛋白质与纤溶酶原的相互作用与晶体入侵有关[52，53]。据报道，纤连蛋白与晶体表面结合，其RGD基序（Arg-Gly-Asp）可与纤溶酶原相互作用，导致纤溶酶-纤溶酶原途径的活化和晶体入侵[18]。我们的晶体入侵试验表明，FL-HSP90具有通过ECM促进晶体入侵的能力。此外，在所有单个域中都观察到了这种促进能力。虽然HSP90没有RGD基序，但其纤溶酶-纤溶酶原途径的活化可能是由于其在晶体表面的直接结合特性和/或其与纤连蛋白的潜在相互作用[69]，纤连蛋白是ECM的丰富成分[70]。此外，我们的发现与之前的报告一致，表明RTEC在响应COM晶体时分泌的α烯醇化酶可以促进晶体入侵[53]。

比较HSP90的4个结构域，N-HSP90和C-HSP90似乎是COM结石过程中最有效的促进剂。另一方面，LR-HSP90在几乎所有的COM结石工艺中表现出最弱的促进活性。LR结构域最弱的促进活性很可能是由于其最小的尺寸，只有35个氨基酸残基。然而，仅凭尺寸并不能解释M-HSP90通过ECM侵入COM晶体时最弱的促进活性。请注意，M是HSP90的最大结构域，含有357个氨基酸残基，占HSP90整个序列的49%。因此，应进一步阐明不同程度促进单个HSP90结构域活性的机制。

总之，我们的研究已经证明了HSP90在肾结石形成过程中的重要作用。FL-HSP90及其功能域（包括N、LR、M和C域）通过ECM过程显着促进了COM结晶，晶体生长，晶体聚集，晶体 - 细胞粘附和晶体入侵。因此，HSP90除了作为COM晶体受体的已知功能外，还充当COM结石形成的启动子。

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