植物单细胞转录组测序面临的挑战（NaturePlants顶刊植物单细胞测序有难点）

近年来，单细胞测序技术发展迅速，在全球已累计发表文章数千篇，不过稍显遗憾的是，在众多的这些文章中，关于植物的研究文章不足10篇。在植物再生领域中，愈伤组织的器官再生能力一直是核心科学问题之一，也是组织再生，基因编辑，植物育种等现代农业分子育种技术得以应用的基础^【1】。但由于大多数植物的茎尖分生组织体积小、细胞解离难度大，导致用于进行细胞及分子层面的研究标本直径往往大小不足100 μm，这使得植物原生质体化获取单细胞存在着巨大的技术难度，也是现今植物领域在细胞和分子机制方面一直鲜少有突破原因之一。所以，和其他生物领域的研究成果相比，植物单细胞研究文章数量近似蓝海。值得一提的是，这一现状以及研究需求促使了单细胞多组学分选系统的诞生，也促进了近几年单细胞测序技术的发展^【2】。

碧迪医疗是高通量微孔单细胞技术的发起者和领导者，在2018年推出了BD Rhapsody™单细胞多组学分析系统。该系统拥有非常高的样本兼容性，能捕获多种类型细胞，其中就包含了植物细胞，以及粒细胞、海洋生物细胞等。该平台在捕获植物细胞上最突出的是，在植物原生质体自然状态或生理状态下，实现单细胞分离和捕获，最大程度上降低剪切力、温度、化学试剂对细胞的刺激和影响，不会改变转录本表达特征，进而真实还原实验设计预期条件。

2021年11月15日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心徐麟研究组于《Nature Plants》（IF=15.793）杂志上发表封面文章“Pluripotency acquisition in the middle cell layer of callus is required for organ regeneration”（图1），利用BD Rhapsody单细胞平台，从单细胞和分子层面揭示了愈伤组织具有器官再生能力的机制。

图1.徐麟研究团队于《Nature Plants》上发表的文章截图

（图源自《Nat Plants》杂志官网）

在该文章中，作者及研究团队通过拟南芥野生型Col-0、拟南芥双突变体（wox5-1 wox7-1和plt1-21 plt2-21）诱导产生的愈伤组织，采用单细胞转录组测序、转录组测序、RT-PCR、免疫共沉淀、细胞谱系追踪、酵母双杂交以及生长实验等多种实验方法，对拟南芥下胚轴产生的愈伤组织展开了检测（图2）^【3】。

那么，为什么愈伤组织能够在不同的激素诱导下再生为不同的器官，而普通体细胞却没有这样的能力呢？

图2.愈伤组织具有再生芽和根的能力

（图源自《Nature Plants》，https://www.nature.com/articles/s41477-021-01015-8）

团队通过单细胞测序获得了10个细胞簇，确认愈伤组织类似于根原基或根尖分生组织大致分为三层：外层细胞类似于根尖的表皮和根冠；中层细胞具有根尖静止中心（quiescent center，QC）的特征；内层细胞类似于根尖的维管初始细胞^【4】。研究运用转录组比较分析、特征基因表达模式观察和细胞谱系追踪等方法，发现愈伤组织中层细胞与根尖静止中心QC有高度类似的转录组特征，也是根和芽再生的源头干细胞（图3）。

图3.单细胞测序中的细胞簇及愈伤组织中层细胞多能性示意图

（图源自《Nat Plants》，https://www.nature.com/articles/s41477-021-01015-8）

在遗传表型方面，根尖静止中心QC的特征转录因子基因WOX5及其同源基因WOX7突变后，愈伤组织的器官再生能力下降；而WOX5/7过量表达可以使愈伤组织在低浓度细胞分裂素的情况下也具有芽再生的能力。分子层面的研究发现，WOX5/7至少通过三条通路促进愈伤组织中层细胞获取多能性：WOX5/7维持愈伤组织中层的干细胞属性；WOX5/7-PLT蛋白复合体能够激活内源生长素合成基因TAA1的表达，促进高浓度生长素的积累；WOX5/7-ARR12复合体能够抑制ARR5基因的表达，从而解除细胞分裂素的负反馈信号通路，达到细胞分裂素超敏感状态。

在此基础上，研究团队进一步通过酵母双杂交、免疫共沉淀、RNA-seq、酵母双杂交、免疫共沉淀技术等技术，证实了WOX5基因可直接与基因PLT1/2相互作用，WOX5/7抑制了A型ARRs（细胞分裂素信号途径反应调节子）和ARR5的表达^【5】。

根据上述结果，团队得出了愈伤组织具有器官再生能力的原理，愈伤组织中层细胞具有干细胞特征，处于未分化状态这一研究结论。并在上述实验结果的数据支撑下，构建了愈伤组织多能性机制的模型（图4）。

图4.愈伤组织多功能性机制模型示意图

（图源自《Nat Plants》，https://www.nature.com/articles/s41477-021-01015-8）

在本篇文章中，单细胞测序技术在植物领域的研究中有着亮眼的表现。

在单细胞测序技术出现之前，植物研究领域中一般使用三种不同的方法来进行单个细胞的转录分析：流式分选(FACS)、单个细胞类型中分离标记的细胞核(INTACT)和激光捕获显微切割(LCM) ，以往的植物转录组学研究手段通常是将植物整个器官或组织均质化后测序，这种方法虽然有助于在器官或组织水平上解决许多生物学问题，但是难以识别每个细胞对转录丰度的贡献，也无法了解发生在罕见细胞类型或单个细胞中的转录过程，并且对于植物物种本身以及样本处理有着极高的要求，单细胞测序技术的出现，则打破了这一僵局。

BD Rhapsody™单细胞多组学分析系统主要亮点：

• 高样本兼容性：基于微孔（Microwell-based）的强大技术和碧迪医疗成熟的流式分选手段，让单细胞实验不再受样本类型的限制；

• 多组学：少有的可同时做转录组，免疫组和蛋白组的单细胞分析平台；

• 高效率低成本：高效的细胞捕获率，支持1-12个样本同步上样、同步建库，有效减少批间差；

• 高质量：Scanner可视化质控系统，确保实验质量，减少实验损失；

• 高品质服务平台：提供系列定制化生信分析方案、配套的生信软件及专业的生信支持团队，生信小白也可轻松上手。

参考文献：

1. Ikeuchi, M. et al. Molecular mechanisms of plant regeneration. Annu. Rev. Plant Biol. 70, 377–406 (2019).

2. Becht, E. et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nat. Biotechnol. 37, 38–44 (2019).

3. Sugimoto, K., Jiao, Y. & Meyerowitz, E. M. Arabidopsis regeneration from multiple tissues occurs via a root development pathway. Dev. Cell 18, 463–471 (2010).

4. Trinh, D.-C. et al. PUCHI regulates very long chain fatty acid biosynthesis during lateral root and callus formation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 14325–14330 (2019).

5. Abe, M., Takahashi, T. & Komeda, Y. Identification of a cis-regulatory element for L1 layer-specific gene expression, which is targeted by an L1-specific homeodomain protein. Plant J. 26, 487–494 (2001).