克隆载体基本特征（除了常规的酶切连接外）

对于做过分子实验的小伙伴来说，传统的分子克隆技术——酶切连接大家应该都是比较熟悉的，那么对于其他的分子克隆技术类型大家有了解过吗？根据不同的实验需求，来选择不同的分子克隆技术以及产品。本期，大家和小编一起来了解下几种常规的分子克隆技术吧。

一、酶切连接

酶切连接法属于经典的分子克隆方法，利用限制性内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA，最后转化筛选及纯化，完成重组基因的大量制备。

图1 酶切连接流程

成功的酶切和有效的连接是分子克隆实验圆满完成的必要条件。限制性内切酶能特异性地结合于能被限制性内切酶识别的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性,可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。分子克隆技术中最常用的是Ⅱ型酶,切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。粘性末端，即限制性内切酶在DNA双链上交错切割，形成的核苷酸顺序互补的，可形成氢键的末端（见图2）。平齐末端，限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断（见图3）。

图2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

图3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

爱必信拥有目前常用的如快速内切酶BsaI（abs60206）、快速内切酶ClaI（abs60209）、快速内切酶EcoRI（abs60213）、快速内切酶HindIII（abs60217）等在内的四十多款限制性内切酶。

表1 爱必信限制性内切酶介绍

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA接酶催化双链DNA子中相邻碱基的5’-P末端与3-0H间形成3’,5’-磷酸二酯键。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被称为生物界的“502”。在有Mg2 和ATP存在的条件下，T4 DNA Ligase能催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化双链DNA的平末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻，但不能催化单链DNA之间的连接。

图4 T4 DNA连接酶作用位点

二、TA克隆

TA克隆是指把PCR片段与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。可用于不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法重组到T-载体中，通过测序测定DNA序列。爱必信T-Vector快速克隆试剂盒（abs60085）是高效、便利的PCR产物克隆专用试剂盒。

爱必信T-Vector快速克隆试剂盒（abs60085）产品特点：1、阳性率高：高纯度酶切型线性T载体，连接效率更高，蓝斑率低于10% 。2、方便快捷：预混连接反应体系，最快5分钟实现连接，无需纯化，直接转化。3、T Simple载体无常用酶切位点，利于含酶切位点基因克隆。4、无NdeI或NcoI位点，便于重组表达基因的克隆。5、提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照 。6、 蓝白筛选：高表达活性的β-半乳糖苷酶，显色更快更深 。7、批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测。

图5 TA克隆流程

三、无缝克隆

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）就是基于重组原理的无缝克隆技术，它不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）特点：

1.简单便捷：兼容PCR产物体系与载体酶切体系，省去繁琐的纯化步骤；

2.高阳性率：定向克隆单个DNA片段至载体上，阳性率高于95%；

3.快速反应：反应时间大大缩短，最快仅需5min。

4.单片段、多片段均可连接：单个或多个片段同时插入，省去重复纯化与酶切过程。

图6 爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）无缝克隆操作流程

四、TOPO克隆

TOPO克隆实际是基于拓扑异构酶的克隆技术，关键是拓扑异构酶。该技术不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。

表2 爱必信TOPO克隆产品

五、Geteway克隆

Geteway克隆利用位点特异重组实现目的片段的插入的，载体上的一段目的片段在重组酶的作用下会替换成目的片段，不依赖限制性内切酶和连接酶，导入目的基因不需要开环处理，载体需要用试剂盒提供的载体，一般需要用到两个载体，快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆。