免疫共沉淀基本原理（CHIP:染色质免疫沉淀原理与实验步骤）

一、CHIP 原理 ：

活细胞中固定蛋白质-DNA复合物，并用酶切或超声打断的方式将其随机切断为200~1000bp的小片段，然后通过特异的抗体沉淀蛋白质-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP常应用于研究转录因子(transcription factor, TF)与启动子( promoter )的互作。 当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸(DNA 或 RNA )之间会产生共价键。产生的共价键非常稳定，后续的超声打断或酶切等处理，皆不会被破坏；即保护了蛋白—DNA复合物的完整性，使得研究活细胞内蛋白质与DNA相互作用提供了可能性。

二、CHIP 流程：

a.甲醛处理细胞，交联固定:靶蛋白-DNA复合物；

b.细胞裂解及超声打断：200~1000bp染色质；

c.抗体与靶蛋白-DNA 复合物相互结合:抗体-靶蛋白-DNA复合物；

d.Protein A/G结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物:

e.沉淀复合物， 并清洗，除去非特异性结合蛋白；

f.洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物

g.解交联，纯化富集的DNA-片断；

h.qPCR 分析验证或测序检测。

三、实验步骤

1. 交联：细胞样本（细胞：1~2*10^7；甲醛：新鲜配制；交联后的样本可经液氮速冻，-80℃保存2个月）

a. 胰酶消化细胞，10ml 1×PBS洗涤两次；每次1000rpm，离心5min

b. 1*10^7 细胞加入10ml 1×PBS(含270ul 37%甲醛，终浓度1%)重悬细胞；颠倒混匀，室温静置10min。

c. 加入 1 mL 1.375 M Glycine(或 0.1 g Glycine)，颠倒混匀器室温中和 5 min;结束后置于冰上。

d. 4 ℃，1000g，离心5分钟收集细胞，弃上层 PBS溶液；

e. 加10 mL预冷的 1×PBS，洗涤两次细胞，每次4℃，1000rpm离心 5分钟收集细胞。

2. 细胞裂解及打断

f. 加入 0.6mL CHIP 裂解液（6 µL Protease Inhibitor，6 µL DTT及6 µLPMSF），重悬细胞；于4℃垂直旋转10min让细胞充分裂解。

g. 进行超声打断；不同细胞系所需的超声处理时间不同，因此这一步骤需要优化。

h. 取25ul样本补水至60ul，加入2.4 µL 5 M NaCl ，65°C孵育过夜；加入1 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 下孵育 1 小时。提取DNA,并电泳确保条带是在200~600bp之间。

h. 超声后溶液8000 g，4℃离心 10分钟，将上清转移到新的离心管中

3. 染色质免疫沉淀

a. 将上清样品按1:10 的比例用 RIPA 缓冲液稀释每个样本；并按照500ul（IP）、500ul（IGG）、50ul（Input）分成三份

b. Input组于-20℃保存

c. IP及IGG组分别加入 ChIP抗体及IGG抗体，4℃垂直混匀器缓慢孵育 1 h

d. IP及IGG组分别加入准备好的 50 µL protein A/G-beads，垂直混匀器上颠倒混匀，4℃孵育过夜

4. 洗涤

a. 4℃静置 10min 后，4000rpm 离心 1min。除去上清；

b. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。

清洗的步骤：加入溶液，轻轻颠倒， 4000rpm 离心 3min，去除上清；

1） 分别在低盐洗涤缓冲液、

2） 高盐洗涤缓冲液

3） 氯化锂洗涤缓冲液中洗涤一次。

5. 洗脱、解交联及DNA提取

a. 在蛋白 A/G 磁珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液，室温翻转15min。

b. 4000rpm 离心 1 min，并将上清液转移至新管中。

c. 加入 4.8 µL 5 M NaCl ，65°C 孵育过夜。

d. 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 孵育 1 小时。

e. DNA提取，提取好的DNA即可用于qPCR或测序实验

PS:如期生物具有完善的CHIP实验平台，欢迎各位老师交流合作：