race如何记忆（你不知道的那些事儿）

近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点逐渐满足不了科研的需求，因此，RACE技术应运而生，接下来，就让小V带大家去了解一下RACE技术吧!~

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RACE 概念

RACE(rapid amplification of cDNA end)也叫cDNA末端快速扩增技术，是已知部分cDNA序列，基于逆转录和PCR快速克隆得到完整的cDNA的3'或5'末端的分子生物学技术。主要类型有3'RACE和5'RACE。

RACE 应用

RACE 原理

(Vazyme#RA101)

Cap-switching 5'RACE原理

逆转录模块(Template-Switching)

第一链cDNA的合成

1.5' CDS Primer 识别RNA3'端poly A尾结构进行一链cDNA合成（若RNA无poly A尾，则可使用 5' Random Primer代替5'CDS Primer）；

2.逆转录进行到mRNA 5'端时，逆转录酶的末端转移酶活性会在cDNA 3'末端加上d(C)；

3.5' TS Oligo接头序列的3'末端带有polyG，可与cDNA末端的d(C)序列结合；

4.逆转录酶继续以5' TS Oligo为模板合成cDNA，完成接头转化；

PCR模块

cDNA末端的快速扩增

5.UP - Long 带有通用引物序列和接头序列，与第一链cDNA 的3'端结合，合成第二链 cDNA ；

6.5'GSP 引物以第二链cDNA为模板合成第三链 cDNA；

7.UP - Short 为通用引物序列，与第三链 cDNA 的 3'端结合，合成互补双链 DNA；

8.UP - Short 与 5'GSP 引物以双链 DNA 为模板进行 PCR扩增。

经典3'RACE原理

逆转录模块

第一链cDNA的合成

1.3'CDS Primer 的5'端带有一段接头序列；

2.3'CDS Primer 识别 RNA 的3'端 poly A尾结构，逆转录合成一链cDNA（若RNA无poly A尾，则需进行加A处理）；

PCR模块

cDNA末端的快速扩增

3.3'GSP 以第一链 cDNA 为模板合成第二链 cDNA；

4.UP - Long 带有与3'CDS Primer 相同的接头序列，识别第二链cDNA的3'端，合成第三链 cDNA;

5.3'GSP 以第三链 cDNA 为模板合成双链 DNA;

6.3'GSP 与 UP - Short 以双链 DNA为模板进行PCR扩增。

RACE实验流程及注意事项

引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们实验预想的目的产物，接下来小v就带大家看看RACE实验中需要用到的引物设计原则吧！

5'/3' GSP(基因特异性引物)设计原则 ：

引物长度：23 - 28个核苷酸，建议不超过30个核苷酸；GC含量：50% - 70%；

Tm值：Tm≥65°C，Tm>70°C使用Touch Down PCR有助于提高产物特异性；对于较长片段(>10 kb)或丰度较低的待测转录本，GSP引物设计尽量靠近cDNA的末端(≤3 kb)；针对同一待测转录本可设计多条GSP，进行RACE扩增以提高成功率。

NGSP(巢式基因特异性引物)设计原则（可选）：

1.引物长度、GC含量、Tm值：同GSP设计原则；位置：NGSP须设计在GSP的3'端，建议NGSP的5'末端与GSP的3'末端有5 - 15 nt的重叠，有助于提高二轮巢式扩增时的特异性。

2.如果上一轮 PCR 没有理想的特异产物（如无扩增产物、产物较弱、产物弥散），或者产物非特异条带过多、基因表达丰度低，巢氏PCR与RACE结合可以提高克隆的准确度，巢式引物结合在上一轮PCR产物的内部，进行PCR扩增可设计多轮巢式引物进行巢式PCR扩增。

友情提醒：巢式PCR可以提高扩增倍数，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，提高了实验的成功率。

常见问题解答

1) 扩增较长片段有什么建议？

➣ 建议扩增片段尽量不超过3 kb，靠近已知序列末端；

➣ 设置温度梯度摸索最佳退火温度；

➣ 检测样本RNA是否降解；

➣ 扩增较长片段时应该适当延长变性时间；

➣ GSP引物设计需要保证较好的特异性；

2) 进行cDNA末端快速扩增时没有明显产物条带？

➣ RNA提取物中无目的转录本或者目的转录本表达丰度低，可以设计已知转录本区域的qPCR或PCR引物进行目的产物检测；检测后发现表达丰度低，可以增加RNA模板投入量；

➣ RNA降解：进行试验前检测RNA的完整度，可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整度；

➣ 设计Nested GSP，进行多轮巢式PCR（一般不超过3轮），富集产物片段同时保证了扩增产物特异性；

➣ 待扩增目的片段过长：提高PCR延伸时间，GSP设计时尽可能放在序列末端；

3) PCR出现明显杂带?

➣ 目的基因属于多基因家族，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP；

➣ 可能是RNA前体具有可变剪接形式，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP;

➣ 扩增非特异性：设计额外的NGSP，进行多轮巢式PCR，将目的产物进行胶回收，再次进行RCP扩增。

4) 5' RACE成功，3' RACE失败是什么原因？3' RACE成功，5' RACE失败是什么原因？

➣ 如果5'RACE能做出来，3' RACE做不出来，大概率是GSP引物的问题；如果3'RACE成功，5' RACE失败，可能与RNA完整度有关。

5) RNA不含poly A尾，加A处理后做了5' RACE 没有出现目的条带？

➣ 逆转录后设计已知序列的qPCR引物或PCR引物，扩增逆转后的cDNA，如果没有扩增说明没有cDNA或含量较低，建议使用随机引物进行逆转，同时选择多条GSP进行PCR；如果有扩增产物，说明逆转录没有问题，可以进行巢式PCR富集特异产物。

6) 引物设计结果为空白是什么原因？

➣ 引物设计结果为空白，可能是没有符合要求的引物序列，可以排查一下引物GC含量，GC含量太低或太高都会产生影响。

7) 5' RACE测序结果与软件比对结果相比多出3个G碱基？

➣ 测序结果多出3个G碱基是RACE过程中加上去的，对实验结果不会产生影响，软件比对时把多出的碱基删除为真正的5'端序列。

8) 克隆产物测序结果不同，如何判断哪个是全长序列？

➣ 转录本本身可能存在多种可变剪接形式，表明两个序列都是正确的。尽量在实验中尽可能地增加克隆数测序，减少实验中的误差。

好啦～，今天的知识点小v就介绍到这里，如果在实验过程中有什么不懂的，可以随时来询问小v，或者直接联系身边的诺唯赞人，我们将竭尽全力为大家提供优质的服务和可靠的产品。最后，希望大家做实验都能做出完美的结果。

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