肾免疫复合物沉积形成结石（肾结石形成早期）

尿石症是影响人类的最常见疾病之一，与多种泌尿系统并发症有关 [ 1 ]。据报道，草酸钙 (CaOx) 会损伤培养的肾小管细胞，之后细胞膜磷脂酰丝氨酸 (PS) 在体外从内层翻转到外层，在肾结石形成中发挥重要作用 [ 2 ]。在细胞水平上进行的各种研究 [3-6 ]也报道了类似的发现。然而，由 CaOx 介导的损伤引起肾小管细胞 PS 外化的潜在机制仍不清楚。先前的研究表明，高浓度的草酸钙会导致活性氧 (ROS) 的过量产生 [ 7]，随后有助于 PS 在肾小管细胞中的外化，导致 CaOx 晶体的成核和生长 [ 8 ]。ROS 和脂质过氧化作用强烈激活磷脂加扰酶 (PLSCR) [ 9 ]，而暴露于 ROS 清除剂，如谷胱甘肽、辅酶 Q10 或艾地苯醌（一种合成辅酶 Q10 同系物），会降低 PLSCR 在多囊肾病中的激活 [ 10 ] . PLSCR 固定在细胞膜上 [ 11 ]，作为三种磷脂翻转酶之一发挥作用，能够催化 PS 在膜两侧沿浓度梯度快速双向移动 [ 12 ]]. 在生理条件下，细胞膜处于不对称状态，PLSCR对细胞膜无影响[ 13 ]。然而，在真核细胞受伤后， PLSCR被激活并将 PS 从内层移动到外层 [ 14、15 ]。此外，据报道，PLSCR 在中国仓鼠卵巢 K1 细胞中的过表达会刺激 PS 外化，从而在细胞凋亡过程中增强 PS 向细胞表面的向外运动 [ 16 ]。因此，我们假设 PLSCR 也通过激活 ROS 参与肾小管细胞膜中的 PS 外化。

草酸盐诱导 ROS 产生的潜在分子机制是通过诱导 TGF-β1/Smad 信号传导发生的，这可能在 ROS 的产生中发挥作用 [ 17、18 ]。事实上，据报道，TGF-β1/Smad 信号转导涉及多种肾脏疾病，例如肾小球肾炎、肾间质纤维化和肾结石 [ 19 ]。此外，用 TGF-β1 处理的单核细胞通过导致 PS 从内层翻转到外层，在细胞膜中表现出 PS 外化 [ 20 ]]. 然而，据我们所知，TGF-β1/Smad 信号与肾小管细胞膜中 PS 外翻之间的关系仍然未知。我们假设 TGF-β1 在 ROS 介导的大鼠肾结石形成早期通过激活 PLSCR 参与肾小管细胞膜的 PS 外翻。

因此，我们研究了TGF-β1/Smad信号是否通过ROS激活刺激PS外化以及TGF是否在体外和体内肾结石发展的早期激活肾小管细胞膜中的PLSCR，从而为病因学奠定理论基础肾结石的形成。

草酸钙介导的损伤后肾小管细胞磷脂酰丝氨酸外翻的机制仍不清楚；因此，我们研究了 TGF-β1/Smad 信号转导对肾结石形成早期肾小管细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻的影响。大鼠早期草酸钙结石模型，流式细胞仪检测肾小管细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，肾组织TGF-β1（转化生长因子-β1）、Smad7、磷脂混杂酶的表达通过蛋白质印迹法测量肾小管细胞膜。我们观察到 TGF-β1/Smad 信号通路增加了生物体水平的磷脂酰丝氨酸外翻。

体外研究结果表明，草酸盐暴露于肾小管细胞会诱导 TGF-β1 表达，增加磷脂加扰酶活性和肾小管细胞膜中的磷脂酰丝氨酸外翻。这些结果表明，在肾结石发展的早期阶段，TGF-β1 通过增加肾小管细胞膜中的磷脂加扰酶活性来刺激磷脂酰丝氨酸外翻。这项研究的结果为进一步详细研究开发专门治疗尿路结石并产生较少副作用的治疗剂奠定了基础。

迄今为止，动物研究既没有关注 PS 在肾结石形成中的作用，也没有解决体外研究的结果是否适用于动物。为了获得更可靠的结果，最好使用体外模型进行研究。在我们的早期 CaOx 结石大鼠模型中，肾结石组的 TGF-β1 水平和 PS 外翻率增加，这与在细胞水平上获得的结果一致，表明随着草酸浓度的增加，伴随增加在细胞膜中-PS 外翻允许晶体粘附在细胞膜上 [ 28]. 因此，我们证实上述细胞学研究适用于检查大鼠模型。我们发现草酸盐本身对细胞有害，它可能作为上调 TGF-β1 的主要药物。此外，SB431542 显着抑制了 TGF-β1 水平和 PS 外化，表明 TGF-β1/Smad 信号通路促进了生物体水平的 PS 外化。通过诱导 TGF-β1 逐步激活肾小管细胞中的 NAD(P)H 氧化酶，是 TGF-β1/Smad 信号诱导 ROS 产生的潜在分子机制 [ 7 ]，而 ROS 介导 MRP-1 或BCRP 在草酸盐诱导的肾上皮细胞膜 PS 外化中起关键作用 [ 23 ]]. 因此，我们得出结论，TGF-β1/Smad 信号诱导肾小管上皮细胞 PS 外翻的机制是通过 ROS 引起的氧化应激介导的。

当 LLC-PK1 细胞用 1 mmol 草酸钾 (KOx) 处理 6、12、24 或 48 小时时，Khan 等人。草酸盐处理 6 小时后，未检测到细胞发生显着的凋亡形态学变化。然而，在暴露 12 小时后，他们观察到显着的细胞凋亡变化，包括核染色质的浓缩和边缘化、DNA 片段化以及质膜双层中的 PS 从内部迁移到细胞表面 [ 8 ]。在我们之前的研究中，我们发现 0.5 mmol 草酸盐导致 MDCK 肾上皮细胞系中 PS 外化的时间和浓度依赖性增加 [ 2]. 在这项研究中，将 0.5% CaOx 应用于细胞，肾结石组的 PS 外翻率增加。尽管在我们目前的研究中细胞膜 PS 翻转，但这些细胞不应该发生凋亡。PS 外翻是细胞凋亡的重要表面标志物。最近的研究表明，细胞凋亡和 PS 外翻是两个独立的事件，即凋亡细胞不一定表现出 PS 外翻，PS 外翻细胞也不一定发生凋亡 [ 29 ]。仅依靠 PS 外翻来确定细胞是否凋亡是不合适的，因为研究报告了非凋亡细胞中的 PS 暴露[ 30-32 ]。

在这项研究中，在对照组细胞中检测到的 PLSCR 水平可忽略不计，而这种蛋白质在 CaOx 组中显着增加，表明 PLSCR 过表达。这些结果与 Singireesu 等人的发现一致。关于 DHCL 对肾细胞的潜在毒性作用 [ 33]. 当 CaOx 组细胞经抗 TGF-β1 抗体处理后，PLSCR 水平显着降低，表明 PLSCR 的激活是由 TGF-β1 介导的。此外，我们观察到 TGF-β1 组和 CaOx 组 NBD-PS 的向外运动增强。当用 PLSCR siRNA 转染来自这些组的肾小管上皮细胞时，PS 内化率增加，而外化率降低，表明 TGF-β1 通过激活肾小管细胞膜中的 PLSCR 引起肾小管细胞膜中的 PS 外化。体外。总之，草酸盐暴露于肾小管细胞会诱导 TGF-β1 表达，从而通过 NAD(P)H 氧化酶增加 ROS 的产生；然后 ROS 改变 PLSCR 的活性 [ 9 , 10]. 最后，PLSCR 导致肾小管细胞膜中的 PS 外化，如我们的研究所示。

之前的一项研究表明，草酸盐处理不会在体外激活 MDCK 细胞中的 PLSCR，因为 PLSCR 激活需要增加细胞质 Ca 2 ，而草酸盐会迅速降低 MDCK 细胞中的细胞内 Ca 2 浓度 [ 2 ]。本研究的结果支持这一假设。也就是说，虽然之前的研究证明了草酸而不是 CaOx 对肾小管上皮细胞的影响，但我们发现在大鼠模型中 CaOx 结石形成的早期阶段，肾集合系统中的 Ca 2 浓度增加. 由于 PLSCR 暴露在细胞膜外，我们认为 PLSCR 可能被 Ca 2 激活在肾集合系统中而不是通过细胞内 Ca 2 。

在生理条件下，真核细胞膜中磷脂的不对称分布需要氨基磷脂转位酶（APLT）和 PLSCR 发挥协同作用，是细胞膜发挥其生理功能所必需的 [ 34 ]。在这个实验中，我们考虑了细胞膜中 PS 外翻的比率来指示 PLSCR 的活性。由于APLT已被证实为导致PS外翻的因素之一，因此APLT影响了本实验中PLSCR酶活性的测定。需要进一步的临床研究来验证 APLT 和 PLSCR 如何在肾小管细胞膜的 PS 外翻中协同作用，并确定控制 PS 外翻的其他因素以更好地了解肾结石形成的潜在机制。

CaOx 暴露可以增强 TGF-β1 的上调，从而激活肾小管细胞中的 ROS；然后 ROS 强烈激活 PLSCR，这是 TGF-β1-ROS 信号在肾结石形成的早期阶段刺激肾小管细胞膜中 PS 外化的主要机制之一。这项研究的结果为进一步详细研究开发专门治疗尿路结石并产生较少副作用的治疗剂奠定了基础。

图1

在对照组、肾结石和肾结石 SB431542 组中观察到晶体形成和 PS 外化。( A) 第 14 天肾组织中的晶体形成；箭头表示微晶结构。(B) 共聚焦激光显微镜观察到的 MDCK 细胞。(C) 外翻率的流式细胞术图。(D) 外翻率 (%)。三角形表示与对照相比P< 0.05。星号表示 与肾结石组相比P < 0.05

Gan XG, Xu HT, Wang ZH. Phosphatidylserine eversion regulated by phospholipid scramblase activated by TGF-β1/Smad signaling in the early stage of kidney stone formation. Urolithiasis. 2022 Feb;50(1):11-20. doi: 10.1007/s00240-021-01292-0. Epub 2021 Dec 3. PMID: 34860265; PMCID: PMC8784500.