pcr技术的基本操作和应用（PCRqPCRRT-PCR）

在学习过程中，我们经常会遇到各种PCR字眼，什么qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR，好多同学看的头晕眼花也没弄明白这几种PCR有什么区别，那你呢？你了解PCR这个大家族吗？还在傻傻分不清吗？今天伯小医就教你一文读懂各类PCR技术，快来学习吧！

一、什么是PCR？

PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR技术自问世以来，在生物科学领域、分子诊断领域、亲子鉴定、法医鉴定以及犯罪调查等方面发挥了巨大作用，是迄今为止最为重要的技术之一。经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代：普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。

图1 PCR仪器的发展历程（Lee NY., 2018）。

二、PCR的原理

PCR的基本原理与DNA的体内复制相类似，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经高温（95℃左右）加热一定时间后，使其解离成单链，以便它与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：将温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链按碱基互补配对的原则结合；③引物的延伸：再将温度调至72℃左右（DNA聚合酶最适反应温度），DNA模板和引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按碱基配对与半保留复制原理，沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这样经变性、退火和延伸重复若干个循环后，就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

图2 PCR的基本反应步骤（图片源自：Wikipedia）。

三、PCR的分类

1.普通PCR

普通PCR即一代PCR，使用普通PCR扩增仪扩增靶基因，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。

2.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）

实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。

①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

优点：价格相对较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。

缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。

②荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5'端标记一个荧光报告基团（Reporter, R），3'端标记一个淬灭基团（Quencher, Q）。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。

优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。

缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。

图3荧光染料法和荧光探针法的工作原理（Cao et al., 2020）。

注：多重PCR，也称多重引物PCR或复合PCR，是在一个反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的一种新型PCR扩增技术。

3.数字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）

数字PCR即三代PCR，是对原始PCR的另一种改进，是一种能够实现核酸绝对定量的精准检测技术，基于泊松分布原理将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝对计数，提高检测灵敏度和准确度。

4.逆转录PCR（ReverseTranscription-PCR,RT-PCR）

逆转录PCR也叫反转录PCR，将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行；而在两步法中两个反应是分开依次进行的。

5.实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR,RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。

图4 RT-qPCR的一步法和两步法（Soleret al., 2020）。

四、结语

最后敲黑板，总结一下：

1.PCR，通常指的是普通PCR，以双链DNA为模板，以dNTP为底物，定性扩增双链DNA。

2.qPCR和Real-time PCR，指的是实时荧光定量PCR，以cDNA为模板，以dNTP 为底物，对扩增出的DNA进行定量分析。

3.RT-PCR，指的是逆转录PCR，以由mRNA逆转录成的cDNA为模板，以dNTP 为底物，进行DNA的扩增，属于PCR的变种，结果只能定性，不能定量。

4.RT-qPCR，指的是实时荧光定量逆转录PCR，是qPCR RT-PCR的组合，将总RNA或mRNA逆转录成cDNA后再作为模板，以dNTP为底物，进行qPCR的定量分析。

表1 不同PCR方法的主要优缺点

参考文献

Cao Y, Yu M, Dong G, et al. Digital PCR as an Emerging Tool for Monitoring of Microbial Biodegradation. Molecules. 2020,25(3).

Lee NY. A review on microscale polymerase chain reaction based methods in molecular diagnosis, and future prospects for the fabrication of fully integrated portable biomedical devices. Mikrochim Acta. 2018,185(6).

Soler M, Scholtz A, Zeto R, et al. Engineering photonics solutions for COVID-19. APL Photonics. 2020,5(9).