动物抑郁症的行为（动物抑郁行为实验专题慢性社会挫败模型的建立方法及注意事项）

以下文章来源于动物神经科学与行为学 ，作者动物行为学

一、CSDS模型研究背景

CSDS的全称是chronic social defeated stress，又称慢性社会挫败应激模型，是一种用来制作动物抑郁模型的方法。在神经精神病学研究领域中，引起人们极大兴趣的是开发有效的抑郁症动物模型，以帮助理解抑郁症背后的神经生物学和分子机制。慢性应激的各种模型已被用于在小鼠中诱发与抑郁相关的症状，其中包括慢性不可预测的应激，足部震颤，固定应激，然后进行性欲减退或类似绝望行为的测量（例如，蔗糖偏爱测试，强迫游泳测试和尾巴悬吊测试），但它们并未很好地验证为人类抑郁症的模型。

当前，慢性社交挫败压力由于其可靠性和可重复性而被广泛接受为抑郁症的有效模型。由于以下原因，社交失败范例已被证明是人类抑郁的良好模型：1）易感小鼠的抑郁表型（社交回避，快感不足，代谢变化等）。可以通过抗抑郁药的长期治疗来逆转，但不能通过急性给药来逆转。2）社会挫败压力会产生易感表型和适应性表型，这可用来解释抑郁症病理生理学中人类压力敏感性的个体差异。3）社交失败压力诱发的易感表型在大脑奖励电路中伴随遗传和表观遗传变化而持久。

二、设备及软件（建议）

1. 透明的鼠笼（带衬垫的一次性鼠笼）
2. 标准水瓶（鼠标水瓶）
3. 带吸管的水瓶塞（氯丁橡胶塞，1英寸弯曲管–尖头）
4. 气缸（定制，用于额外注水的塑料支架）
5. 分压器（定制，透明的多孔有机玻璃板）
6. 可移动外壳（定制，透明有机玻璃，顶部和底部打开）
7. 秒表
8. 开场实验箱（定制，44 [w] x 44 [d] x 30 [h] cm）
9. 用于社交互动测试的视频跟踪系统（例如，上海欣软，VisuTrack动物行为分析软件，CCD摄像头和计算机）

三、 慢性社交挫败应激模型的建立

（1）传统 CSDS 建模方法

该部分实验内容是参照了有关文献：Kudryavtseva NN，Bakshtanovskaya IV，Koryakina LA. Socialmodel of depression in mice of C57BL/6J strain［J］. Pharmacol Biochem Behav，1991，38（2）：315-320.

首先根据需要选取一定数量的CD 1小鼠作为攻击性小鼠，在正式实验前2-3周开始对其攻击性进行筛选。具体方法就是:每个饲养笼中饲养雄性和雌性两只周龄相近的CD1小鼠，一定时间内让CD1雄性小鼠产生领地意识；1周以后，将配对饲养的雌鼠分离出饲养笼，随机放入一只陌生的C57小鼠作为领地入侵者，如果CD1雄性小鼠在1 min之内就开始对C57小鼠发动攻击，那么该CD1小鼠则被视为攻击性CD1小鼠。运用同样的方法筛选出所有需要的攻击性雄性CD1小鼠。

正式实验前，选取雄性C57小鼠(7周)，随机分配成正常组和应激组，每组10只，对照组每2只一笼，其余均单笼饲养，给正常饮食饮水一周充分适应环境。当实验开始时，提前分离CD1雌鼠，取模型组C57小鼠一只，直接放入陌生雄性CD1小鼠（8-9周）饲养笼中，使C57小鼠遭受雄性CD1小鼠持续性攻击约5-10 min;然后将两只小鼠用带有密集小孔的透明塑料隔板隔开，使两只小鼠彼此仍能互视和闻嗅但是无法接触，运用这种方法持续到下次进行攻击前为止，完成该过程后即为第一天应激。

第二天再将该C57鼠放入另一不同的CD1雄性鼠的笼中，使C57小鼠受到相同程度的应激;第三天再放入第三只CD1雄性鼠的笼中，同样使C57小鼠受到同样程度的应激。如此连续应激10天，并保证每天同一只C57小鼠受到不同CD1雄性鼠的攻击。在此期间，对照组和应激组C57小鼠均维持正常饮食饮水，而对照组则保持2只一笼，每天相互更换接触不同的小鼠。

（2）改进型慢性社交挫败应激（CSDS）

模型的建立CSDS模型的构建方法参照文献：Golden SA，Covington HE 3rd，Berton O，et al. A standardizedprotocol for repeated social defeat stress in mice［J］. Nat Protoc，2011，6（8）：1183-1191.

将CD­1小鼠单笼饲养 7 d 产生领地意识，C57BL/6 小鼠 4~5只饲养 7 d 适应环境。首先筛选 CD­1 小鼠的攻击性，将C57BL/6小鼠置CD­1小鼠笼中3 min，若CD­1小鼠发起攻击多于 5 次且攻击潜伏期< 1 min，认为有攻击性，在 3 d 中至少 2 次有攻击性，可作为模型中的攻击鼠。实验组（Sus）小鼠进行 10 d 的 CSDS，即将实验组 C57BL/6 小鼠连续 10 d 放入 CD­1 小鼠笼中，被攻击 5~10 min后用一带孔透明亚克力板隔离24 h，每天更换新的CD­1小鼠避免适应。10 d后将实验组C57BL/6小鼠取出并单笼饲养。而非应激对照组（Con）为同周龄C57BL/6小鼠，每天与无攻击性 C57BL/6 小鼠接触 5~10 min 后用相同的板隔离24 h，每天更换新的C57BL/6小鼠。10 d结束后将非应激对照组C57BL/6小鼠取出并单笼饲养。

四、CSDS模型的检测方法

10天连续应激结束后即开始行为学测试。根据糖水消耗，社会接触的行为学和悬尾测试的结果将C57小鼠分为正常组，抑郁敏感组，抑郁非敏感组。

（1）糖水偏好实验

糖水偏好测试是检测抑郁症快感缺失的经典方法。根据文献稍做修改。首先给予小鼠两瓶清水，24 h后将其中一瓶换成1%蔗糖溶液，称重并记录两瓶质量，12 h后交换瓶的位置避免方向偏好，经过 24 h 测试后再次称重，糖水偏好系数为：糖水消耗质量/总消耗质量。

参考文献：Liu MY，Yin CY，Zhu LJ，et al. Sucrose preference test for measurement of stress ­induced anhedonia in mice［J］. Nat Protoc，2018，13（7）：1686-1698.

测试前用自来水配制好1%蔗糖水，与不含蔗糖的正常自来水同时放在C57模型鼠的鼠笼处，保证其自由饮用，同时提供充足的鼠食，每12h将糖水和白水互换位置，以防止C57模型鼠产生位置偏好。到第三天将所有的水和食物同时撤走，将C57模型鼠禁食24 h。禁食结束后分别称量糖水和白水的重量并记录，然后将两瓶水随机放在饲养笼上供模型鼠自由饮用，1h后取下两瓶水分别测量两瓶水剩下的重量，计算出糖水消耗重量A和白水消耗重量B，利用公式A/（A B）X 100%即得到CSDS模型鼠的糖水偏好率。糖水偏好率的值与动物的快感程度呈正相关，其值越小则表明动物快感缺失越严重。

（2）社会互动实验/社会接触实验

该实验方法主要用于检测小鼠对陌生目标的靠近，探索和躲避行为。正常的啮齿类动物是社会性动物，当正常鼠与陌生鼠相遇后会与陌生鼠频繁接触;而遭受过社会挫败应激的小鼠则会产生孤立和逃避接触的行为，该行为一般判定为抑郁样行为;而相比之下，在一定的时间内，正常鼠在单位时间内与正常鼠接触的时间明显长于模型鼠在单位时间内与正常鼠接触的时间，因此，在规定时间内计算出模型鼠与攻击鼠接触的时间能反应出模型鼠的抑郁程度。其具体操作方法是:在敞箱(45X45 X 45cm)一侧的中央放入隔板(10 x 6cm，底部有密集小孔，用来放置陌生CD1小鼠)，以中央放置CD1小鼠的区域为中心，划出一矩形区域作为接触区域(14x26 cm ) }46}。结果通过由上海欣软信息科技有限公司公司提供的VisuTrack软件进行接触时间的统计。

使用VisuTrack 软件记录小鼠在社交互动区以及角落区的时间，社交互动比率（social interaction，SI）为：第二阶段在互动区的时间/第一阶段在互动区的时间。认为 SI<1 的小鼠表现出社交回避为敏感型，SI>1的小鼠表现出社交偏好为抵抗型。

整个实验步骤如下: （1）打开软件和摄像头后将实验笼放置到合适的位置，然后进行软件的设置; （2）不放入陌生的CD1小鼠，然后放入C57小鼠，然后开始计时，时间设定为2.5 min，最后得到接触区和非接触区的累积时间，此阶段为Target absent; （3）放入陌生的CD1小鼠，然后放入C57小鼠，然后开始计时，时间设定为2.5 min，最后得到接触区和非接触区的累积时间，此阶段为Target present; （4）分别统计对照组和模型组的Target absent和Target present的累积时间，在Target absent阶段，对照组和模型鼠无明显差异，但是在Target present阶段，模型鼠的接触时间明显降低。

（3）强迫游泳实验和悬尾实验

强迫游泳实验 ：强迫游泳实验是用于评价动物抑郁样行为的经典实验［12］。实验装置为3 L烧 杯，在其中加2 L清水，水温在（22±1）℃，2只动物之间应更换清水。实验第 1 天将小鼠置烧杯中，游泳15 min 后取出擦干。第 2 天将小鼠置烧杯中，计时6 min，记录后4 min的不动时间。

悬尾实验：将高60cm的架子放置于安静的实验环境中，用夹子夹住小鼠尾巴末端1cm处，然后将夹子固定在架子上，使其倒吊于架子上，小鼠为克服不正常体位而挣扎活动，在此期间记录小鼠的不动时间。总共时间为6min，开始1min为适应时间，随后5min为记录时间，记录分析软件同样为VisuTrack软件。

（4）高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验是对焦虑样行为进行分析的经典测试。迷宫由2条垂直的跑道（宽 5 cm×长 35 cm）组成，一条跑道由15 cm高墙包裹（闭合臂），另一条跑道无包裹（开放臂）。2 个臂通过中心区域（5 cm×5 cm）连接，距地面 40 cm。在测试开始时，将小鼠置中央区域面对开放臂，记录在开放臂和闭合臂上的时间，整个实验共记录5 min。

（5）Y 迷宫实验

Y 迷宫实验可用于评价小鼠的空间记忆能力。迷宫由 3 个臂组成（8 cm×30cm×15 cm），两臂间夹角为 120°。在第一阶段将其中一个臂关闭，放入小鼠任其自由探索15 min。1 h后开始第二阶段，打开先前关闭的臂，计时5 min，记录小鼠在新臂中的探索时间。

五、探讨

（1）CSDS引起小鼠生理指标改变

我们发现，在CSDS模型中经过10 d的社交挫败应激之后，应激敏感组小鼠（n=23）的体质量与非应激对照组小鼠（n=20）相比显著减轻（P=0.002）。与此同时，对两组小鼠进行血糖监测时发现，随着社交挫败应激的进行，敏感组小鼠的血糖逐渐增加。

（2）CSDS引起小鼠焦虑样行为

我们通过旷场和高架十字等行为学方法对CSDS模型小鼠的焦虑样负性情绪进行了分析评价。在旷场实验中，我们发现，与非应激对照组小鼠（n=18）相比，应激敏感型小鼠（n=21）在旷场中活动的距离显著降低（P=0.0008），表现出探索减少的行为。同时，小鼠在旷场中心位置活动的时间也显著减少（P=0.0002），更喜欢贴壁行走或躲在角落中。可见，应激敏感组小鼠表现出更高的焦虑样行为。但在采用高架十字迷宫进行验证时发现，应激敏感组小鼠（n=21）较非应激对照组小鼠（n=18）在开放臂的活动时间也稍有减少，但未见显著差异（P=0.3）。

（3）CSDS导致小鼠抑郁样行为

我们借助糖水偏好实验、强迫游泳实验以及悬尾实验等评价动物抑郁样行为的经典行为学实验， 对 CSDS 模型小鼠进行了系统研究。其中，糖水偏好实验反映小鼠是否出现快感缺失；强迫游泳以及悬尾实验反映小鼠是否存在绝望行为，这两点是抑郁症患者的经典行为改变。

（4）CSDS引起小鼠空间记忆受损

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