植物基因克隆功能验证流程图（新的植物基因编辑方法无需组织培养）

2020年6月1日，Nature Plants 杂志在线发表了来自明尼苏达大学Daniel F. Voytas课题组题为“Multiplexed heritable gene editing using RNAviruses and mobile single guide RNAs”的研究论文。

该研究开发了一种使用RNA病毒载体表达可移动的sgRNA，并实现在植物体内高效，多重，遗传基因编辑的方法，最为重要的是该方法不需要组织培养，就可以获得稳定遗传材料。

值得一提的是，该课题组在2019年12月，Nature Biotechnology杂志在线发表了题为“Plant gene editing through de novo induction of meristems”的研究论文。该研究同样报道两种通过从头诱导分生组织产生植物基因编辑的方法，并能获得稳定遗传植物。

综上，该课题组开发以上两种方法可避免了组织培养的需要，并有望克服植物基因编辑的瓶颈。

在气候变化和人口增长的情况下，借助植物生物工程可能会产生高产和抗逆的作物。然而，与哺乳动物细胞不同，植物细胞具有细胞壁，构成了外源生物大分子递送的主要屏障。常规植物生物大分子投递方法中，农杆菌介导和基因枪是最成熟和最受欢迎的两种工具。但是这些方法需要植物组织培养生成愈伤组织，或只能针对狭窄范围的植物物种。迄今为止，植物遗传转化缺乏一种能允许递送不同的生物分子进入所有植物组织和物种，而不需要借助外力并且不引起组织损伤。为此，寻找一种能通过细胞壁或者不需要组织培养的转化方法成为植物转基因及基因编辑的主要研究方向！

前年以来，一系列的文章报道碳纳米管和纳米片及DNA纳米结构通过表面接枝或封装策略将DNA和RNA生物大分子能通过植物细胞壁递送植物细胞内，从而避免使用外力和组织损伤，这是植物遗传转化中重要的进展！这些研究确定了利用碳纳米管或DNA纳米结构可将生物大分子递送到植物细胞内的可行性。

以上报道证实了利用纳米材料为载体进行无组织培养的转基因及植物基因编辑在某种程度上是可行的。然而，如何将转基因或基因编辑能稳定遗传到下一代仍然是需要解决的问题。

烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默(TRV- VIGS), 是目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。该方法是将目的基因插入TRV病毒载体中,制备重组载体,然后转化农杆菌,再接种植物，之后该病毒可扩散到受体的根、茎、叶等器官。TRV-VIGS已在茄属的番茄、烟草、辣椒、拟南芥、麻风树和矮牵牛等植物上成功应用。以前有研究使用RNA病毒TRV载体递送sgRNAs到表达Cas9的转基因植物中，但是结果表明体细胞中基因编辑的效率较低，并且植物后代的突变效率很低。因此，虽然该方法具有明显的优势，就是不需要组织培养，但是问题是后代突变率低，那么是否有改进的可能？

该研究通过利用植物体内FT基因的RNA在叶维管束组织中转录，然后会移至茎尖分生组织以诱导开花的现象，将FT RNA与sgRNA融合后克隆到TRV载体中，则FT可能会促进sgRNA进入茎尖分生组织并以较高的效率产生可遗传的基因编辑。

因此，该研究设计了靶向烟草PDS基因，该基因的突变会产生白色斑点叶表型。研究表明被重组的TRV感染表达Cas9的转基因烟草约2.5周后会出现表型，并随着植物成熟而强度增加，说明了该系统成功在烟草中起作用（如下图）。进一步研究表明至少65％的后代幼苗中至少有一个PDS等位基因突变，表明RNA迁移序列增加了总体病毒积累，进而导致可遗传基因编辑的频率更高。

之后，研究表明该系统还可以通过同时表达多个sgRNA同时靶向多个基因座，并且来自多突变载体上的单个位点上的遗传编辑效率可与单个sgRNA本身的传代相比，并且能够获得后代有两个或三个目标基因座处发生突变的植物。

综上所述，该研究方法减少了组织培养的需要，这是基因编辑的当前瓶颈。只需要生成最初的Cas9转基因植物，就可以重复使用该植物来创建几乎无限的基因编辑植物。由于TRV被广泛用作作物和模型植物基因功能研究的VIGS载体，表达移动sgRNA的TRV载体可用于在多种植物中创建可遗传的基因编辑，从而有助于实现任何植物基因编辑的可能性。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-020-0670-y