富集微生物的原理（CellChem.Biol.）

引言

通过泛素蛋白酶体系统降解疾病相关蛋白的靶向蛋白降解嵌合体(PROTACs)已成为药物发现领域的革命性技术。当前多数PROTAC对靶蛋白和E3连接酶均使用可逆非共价配体。本综述则详尽探讨了共价配体(包含可逆和不可逆)在蛋白降解(TPD)中的作用及优势。

共价抑制剂

市场上约有60%的药物直接来自于天然产物，而许多天然产物则通过各种亲电弹头与靶标形成共价键来结合。但出于对共价药物脱靶及潜在毒性的担忧，共价药物的发展在很长一段时间内陷入停滞，随着越来越多广泛使用药物(阿司匹林、青霉素、奥美拉唑等)的共价机制被阐明及迈克尔受体类化合物(阿法替尼等)被成功应用，共价抑制剂才逐渐复苏且发现过程由偶然变得理性。与非共价抑制剂相比，靶向共价抑制剂(TCIs)的优点是显而易见的：高效力和高选择性，更少给药量，靶向难药靶标及避免耐药突变等。

共价反应机理有两步，第一步分子骨架与靶标形成高亲和力的可逆复合物，速率为Ki。然后弹头与亲核残基形成共价键，速率为k2。对不可逆抑制剂来说，k-2=0， k-2则代表了共价复合物EI返回非共价复合物E·I的趋势，当k-2不等于0时，为可逆抑制剂。(图1)

最近，无论是对靶蛋白还是E3连接酶，可逆和不可逆TCI在靶向蛋白降解领域的应用都大有势头。本文旨在展示这项策略的优势及潜力，以进一步扩大蛋白降解的靶标范围。

图1. 共价抑制剂的反应机理

图片来源于Cell Chem. Biol.

PROTAC

PROTAC是一个两头含有不同配体的化学分子，一头是结合E3连接酶的配体，另一头是结合细胞内蛋白的配体，这两个配体再由一段linker连接起来。这样的化学分子既可以结合E3泛素连接酶，又可以结合胞内蛋白，通过把靶蛋白招募到E3泛素连接酶附近来实现靶蛋白的多泛素化，最后被26S蛋白酶体降解。(图2)

图2. PROTAC介导的靶标降解的催化机理

图片来源于Cell Chem. Biol.

小分子抑制剂需持续占据靶蛋白的活性位点以阻断功能，属于“占位驱动”,因此需要药物剂量够大使靶点饱和；半衰期够长能持续抑制；亲和力够高能竞争过底物。这些要求带来一系列问题，如毒副作用，脱靶毒性及耐药。而PROTAC机制则是“事件驱动”，只提供结合活性，触发靶蛋白和E3酶结合从而引发降解，不需要直接抑制靶蛋白功能活性也不需要药物与靶蛋白长时间高强度地结合。具有靶向难药靶标的潜力并可减少毒副作用。

PROTAC迄今为止已成功降解的靶标种类有：激酶、多通道跨膜蛋白、细胞表面蛋白(PD-1)的溶酶体。另有两个分别针对雄激素受体和雌激素受体的PROTAC，ARV-110和ARV-471，目前进入治疗前列腺癌和乳腺癌的一期临床。一种治疗阿尔茨海默症的TATAC甚至被证明穿过了血脑屏障。对于这些不符合类药五规则的化合物来说是一个令人印象深刻的壮举。这些结果表明PROTAC方法有开发有效疗法的巨大潜力。

与靶蛋白不可逆共价结合的PROTAC

与靶标不可逆地共价结合，将消除PROTAC机制的上述优势。第一个PROTAC-1通过与MetAP-2共价结合来完成降解但因其E3连接酶募集部分渗透性差故并没有进行细胞测试。从那时起，关于PROTAC与靶标共价结合的报道就逐渐变少，可能是因为从药代动力学优化角度看失去了催化靶标转化这一重大缺点。而且对这类的功效一直有争议甚至对同个靶标降解有相互矛盾的报道。最近又有PROTAC用共价弹头成功降解靶蛋白的成功报道，包括ERK1/2、BTK和KRASG12C。

用小分子抑制剂靶向BTK已成为治疗CLL的一种有效验证的治疗策略。一线药物依鲁替尼使用丙烯酰胺亲电弹头不可逆地与BTK激酶结构域中的Cys481结合。为了评估共价结合对PROTAC介导的BTK降解的影响，Tinworth等人合成了非共价和基于依鲁替尼的共价PROTAC用于比较研究，招募E3酶的配体来自凋亡蛋白抑制剂IAP。共价PROTAC2和可逆PROTAC3在生化分析中显示出对BTK的抑制作用但前者在细胞测试中并未观察到BTK降解，更换招募E3酶的配体为结合CRBN配体时也出现了类似的结果。于是作者得出结论共价键会抑制靶标降解，这是由于泛素转移到表面赖氨酸的损伤或阻碍了蛋白酶体识别所需的靶蛋白内在无序区域的呈现。薛等人的最新报告提出了一种成功降解BTK的共价PROTAC。合成的一系列PROTAC利用了两种与BTK结合部分不同的共价配体：依鲁替尼类似物和PLS-123，两者亲和力高且骨架有显著差异，招募E3酶的配体也有两种，分别结合CRBN和VHL。基于依鲁替尼类似物的CRBN PROTAC的BTK降解水平为50%，基于PLS-123的CRBN PROTAC则可以提高降解水平到75%。后续更换招募配体为VHL032时，比结合CRBN的配体降解BTK的水平更高，基于依鲁替尼的PROTAC最大BTK降解达到88%。将丙烯酰胺弹头更换为饱和的丙酰胺后的PROTAC9为可逆化合物，细胞实验表明，共价PROTAC7降解BTK的程度更大，此外，对BTK的IC50值表示PROTAC7是更有效的BTK抑制剂和降解剂。(图3)

另一种说法认为，这些研究的差异可能与靶标降解和共价键形成的相对速率有关，Gabizon等观察到他们的IR-2形成共价键的速率慢于BTK降解速率，这很可能是由于丙烯酰胺的反应性较低。野生型和C481S突变体BTK之间不可逆PROTAC的降解功效没有显著差异，表明共价键没有参与，即在共价键还没形成时PROTAC便完成了BTK的降解。Riching的研究则支持了这一理论，他们发现靶标降解的初始速率与形成的三元复合物的稳定性和协同性呈正相关。因此，可能的说法是，已成功降解靶标的共价PROTAC是因为形成稳定的三元复合物，降解速率快于共价键形成速率，而共价键的形成则损害了靶标的降解导致三元复合物不稳定进而出现降解失败的PROTAC。

图3. 与靶蛋白不可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

与E3连接酶不可逆共价结合的PROTAC

与靶标共价结合的PROTAC可能是有效的降解剂但其失去了催化转化靶标的能力。但是，使用共价配体募集E3酶的PROTAC可能保留了共价结合和催化转化靶标的所有药代动力学优势。

在人类基因组编码的约600种E3酶中，成功的蛋白降解剂募集的不到10种，其中只有4种被广泛靶向：CRBN,VHL,IAP和MDM2。这主要是由于小分子配体的缺乏。最近人们发现了先前未靶向的E3连接酶的新配体，特别是最近已验证的E3酶RNF114,RNF4和DCA16的共价配体，与可逆E3酶募集配体相比更有优势。

使用nimbolide作为PROTAC的E3连接酶招募配体会产生有益的协同作用，从而降解靶蛋白，并通过与RNF114的Cys8共价结合来稳定抑癌基因p21和p57，实验表明抑制二者的泛素化和降解可以促进其稳定，而它们的稳定化有助于nimbolide的抗癌作用。Tong等人已证明可将nimbolide掺入降解剂中以成功募集RNF114并降解BRD4。募集MDM2的PROTAC也采用了类似的协同策略，比募集VHL的PROTAC具有更强的抗增殖作用且对相同靶标(BRD4)具有相似的降解能。为扩展招募RNF114的共价配体库，Nomura使用ABPP方法筛选了针对RNF114的Cys反应性的共价配体库，发现了EN62，该片段与nimbolide结合位点一致但需要对其通透性及选择性等进行优化。它为未来RNF114共价配体优化提供了一个良好的起点。CCW16是E3连接酶RNF4的抑制剂(IC50=1.8µM),CCW16与JQ1连接形成的PROTAC CCW28-3在竞争性ABPP分析中对RNF4的效力比原配体CCW16更高，IC50为0.54µM。对同源BET家族成员BRD2和BRD3没有降解表明其优越的选择性，且将RNF4敲除后并未观察到CCW 28-3介导的BRD4降解，进一步支持了CCW 28-3的RNF4募集机制。实验发现DCAF16的减少会显著削弱片段降解剂KB02-SLF(弹头为氯乙酰胺)介导的多泛素化合核FKB12的降解，作者还试图研究DCF16募集是否会导致其他核蛋白如BRD4的降解,结果表明PROTAC KB02-JQ1成功促进了HEK293T细胞中BRD4呈剂量依赖性降解，在DCAF16敲除细胞中降解明显减弱。这些研究强调了这些广泛反应的共价片段的实用性，可成为开发缺少配体的E3连接酶的配体的有价值的起点。(图4)

图4. 与E3连接酶不可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

与靶蛋白可逆共价结合的PROTAC

可逆共价PROTAC的研究也是在BTK靶标上研究的，只是与靶蛋白共价结合的弹头由不可逆的丙烯酰胺变为可逆的氰基丙烯酰胺。理论上讲，可逆共价PROTAC有不可逆共价PROTAC不具有的亚单位的靶标转化。

为比较不同弹头对靶标降解的影响，郭及同事设计了3种BTK PROTAC:RNC-1,RC-1和IRC-1，分别与BTK形成可逆非共价键，可逆共价键和不可逆共价键。细胞实验表明IRC-1诱导BTK降解的效率不高但RNC-1和RC-1均成功诱导了BTK降解，且低浓度上RC-1比RNC-1更有效。改变linker长度后发现最初的RC-1效果是最好的，是迄今为止最有效的BTK降解剂之一，DC50为6.6nM。生化抑制试验也有类似的结果。通过计算PROTAC的胞内浓度发现，RC-1在细胞内的蓄积比不可逆共价和可逆非共价高10倍和16倍，C=C被还原或氰基被去除的化合物作为对照，RC-1的胞内积累比对照物也要高5倍。这些结果表明，RC-1诱导的有效BTK降解及生长抑制主要归因于其高胞内浓度，突出了氰基丙烯酰胺的重要性。(图5)

图5. 与靶标可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

与E3连接酶可逆共价结合的PROTAC

Tong等人在共价E3连接酶配体的成功上，决定探索可逆E3连接酶的募集来达到避免永久性的蛋白修饰和潜在的毒性。CDDO-Me通过α-氰基烯酮部分与E3连接酶KEAP1的Cys形成可逆共价键。该活性还导致Nrf2的活化，Nrf2是氧化应激的主要调控因子，在疾病状态下被KEAP1异常泛素化，降解和抑制。因此，招募KEAP1的PROTAC可能表现出类似稳定p53的RNF114-PROTAC的有益协同机制。将CDDO通过linker连接到BET抑制剂JQ1上，该抑制剂以蛋白酶体依赖性方式成功降解了BRD4,成为第一个使用可逆共价配体募集E3连接酶的PROTAC，扩大了可配体E3连接酶的范围。(图6)

图6. 与E3连接酶可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

总结

本文回顾了可逆和不可逆化学在TPD中的最新作用，众多研究表明，使用可逆共价化学或不可逆共价抑制剂的PROTAC可能是高效的降解剂，尤其是可逆共价化学结合了共价结合和催化靶标转化的优势，还有其独特的优势如更高选择性及改善药物传递的潜力。期望在这领域取得进一步进展来阐明共价PROTAC的机制，并利用其潜力来攻克更多的难成药靶标。

参考文献

Kiely-Collins, H., Winter, G. E., Bernardes, G. J. L., The Role of Reversible and Irreversible Covalent Chemistry in Targeted Protein Degradation, Cell Chem. Biol. 2021, In press. DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.03.005

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