自生固氮菌菌株的筛选（ACSCatal.突变增加辅因子亲和力提高Baeyer-Villiger单加氧酶的稳定性和活性）

今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Mutations Increasing Cofactor Affinity, Improve Stability and Activity of a Baeyer–Villiger Monooxygenase”，通讯作者为通讯作者为维也纳科技大学应用合成化学研究所的Florian Rudroff。

蛋白质的化学选择性、区域选择性和对映选择性往往优于对应的化学反应，但蛋白质在有机溶剂、高底物或产物浓度存在以及高温下的稳定性通常会降低。酶优于传统化学催化的一个突出例子是Baeyer-Villiger氧化。在化学合成中，酮被过酸或过氧化物氧化成相应的酯或内酯。这些强氧化剂通常具有爆炸风险，甚至有毒，通常不兼容其他官能团，并且不像酶那样具有立体选择性。一种“更环保”的催化替代方案是使用Baeyer-Villiger单加氧酶 (BVMO)。这些酶需要烟酰胺和黄素辅因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADPH 和黄素腺嘌呤二核苷酸，FAD）和空气中的氧气来进行Baeyer-Villiger氧化。

BVMO因其出色的化学选择性、区域选择性和对映选择性而优于传统化学催化。BVMOs因其合成潜力而受到高度评价，但它们在工艺条件下的稳定性差迄今为止阻碍了它们的工业应用。在高温和有机溶剂存在下，BVMO通常会在几分钟内失活。在本研究中，作者选择CHMO_Acineto应用于稳定化的模型催化剂。CHMO_Acineto能够接受广泛的底物，对Baeyer-Villiger氧化具有高选择性。尽管这种酶的催化活性和选择性对工业应用很有价值，但其稳定性不足的问题仍未解决。几项研究已经通过使用蛋白质工程来解决这一限制。尽管稳定性有所提高，但所有变体的活性都低于野生型 (WT)酶，且这些突变体生产ε-己内酯的能力都低于野生型酶。

由于以前的热稳定性工程尚未达到高稳定性和活性的预期结果，作者设计了以下组合工程策略：（i）合理设计增加对FAD辅因子的亲和（ii）应用结构引导的共识方法，比较31个BVMO 序列和（iii）通过改变序列中的“热点“提高CHMO_Acineto稳定性和活性。通过该组合策略，作者构建了三代突变库（L1-L3，图1）。这些突变体在其活性、选择性和催化效率以及它们的热力学 (T_m)和动力学稳定性 (t_1/2) 方面得到充分表征。

首先在L1中，作者解决了CHMO_Acineto辅助因子FAD的低亲和力问题，我们在早期研究中确定了K_d= 1-3 μM。CHMO_Acineto需要通过Rossmann折叠与脱辅基酶非共价结合才能获得催化活性。先前研究证明添加FAD能够将野生型的动力学稳定性提高7倍，并且这种效果与其他添加剂引起的改进具有协同作用。但以前的研究都没有研究过Rossmann折叠突变对FAD结合亲和力的影响。根据这一发现，作者假设通过蛋白质工程增加对FAD的亲和力可能对酶稳定性产生积极影响。

作者研究了BVMO的多个序列，特别是它们的Rossmann折叠，发现具有高稳定性BVMO（TmCHMO、PAMO）在第14位（Rossmann折叠中的第二个位置）携带丙氨酸。CHMO_Acineto在对应位置有一个甘氨酸。因此选择G14A作为第一个突变 (L1-1)，并分别使用差示扫描荧光法 (DSF)和NADPH消耗测定法测量CHMO-L1-1的热力学和动力学稳定性和活性（图2）：活性增加13%，热力学稳定性增加1.4 °C（Tm），动力学稳定性比野生型高30%。G14A突变体与FAD的结合亲和力比野生型高8倍。这些结果证明第14位是影响稳定性的关键残基，可以同时增加稳定性和活性。

随后作者对第14位氨基酸进行了饱和突变。除G14A和G14R外，所有突变体活性都降低，甚至检测不到活性。其他突变体的热力学稳定性也远低于野生型。这些结果与BVMO的进化分析兼容，其中仅在14位发现甘氨酸和丙氨酸。引入精氨酸并没有完全消除CHMO_Acineto活性（野生型的30%），同时了热力学稳定性提高（ 0.3 °C）。通过从较差或无法检测到的活性推断，除A或W之外的G14突变可能会强烈降低对FAD的亲和力，但根据我们的数据，我们不能排除缺乏活性的其他原因。

接下来，作者设想通过结构引导的共识方法进一步提高稳定性，这是一种利用结构信息和所需酶功能的数据驱动方法。该方法假设氨基酸的普遍性与蛋白质的稳定性正相关，共有残基将比非保守氨基酸更稳定。这种方法通常适用于同源性较低的一小部分序列，例如BVMO（图 1）。为了创建共有突变体，设计中仅允许距离活性位点超过6 Å的位置（基于同源模型），不直接干扰酶活性或对底物的亲和力。通过这些原则作者选择和创建了七个突变体，其中包括先前测试的突变体L1-1 (G14A)。发现N336E替代对活性的改善最大（活性比CHMOwt高40%）。最高的热力学稳定性来自先前表征的G14A (Tm 1.4 °C) 和L1-7 ( 0.9 °C)， 且动力学稳定性分别比WT增加30%和20%（图2）。

随后通过结合第一代的最佳突变体设计了第二代突变体库，这进一步提高了稳定性（Tm高 3°C， 半衰期为野生型的3倍），且活性比野生型增加40%（图2）。成功组合之间共有的突变包括G14A、N336E、Q451K、T453A、V454E、Q473R和N477E。作者创建了一个由五个变体组成的第三个库，这些变体将第二代的最佳突变与三个文献已知的增加稳定性的突变相结合（表 S2）：（i）T415C/A463C被证明有益于提高动力学稳定性；(ii) 用异亮氨酸 (M400I) 替代对氧敏感的蛋氨酸。第三代的所有突变体都比野生型更稳定（热力学和动力学）并且具有同等或更高的活性。L3的最佳候选物比CHMOwt活性高51-55%，热力学稳定性高 4°C；它们的半衰期是野生型的 5-8 倍。新突变体的总周转数是野生型的8倍（图2）。

作者使用从库L2和L3中选择的六个突变体以及五个取代的环己酮和环丁酮来测试突变是否改变了对映选择性或底物范围。结果未发现突变体与野生型的显着差异。在所需底物的存在下，通过全细胞生物催化进行底物筛选。通过GC测量分析转化以排除基于解偶联反应的活动。确定了两种突变体L1-1（G14A，改进的FAD结合）和L3-4稳定性最佳突变体（G14A、N336E、M400I、Q451K、Y452Y、T453A、V454E、Q473R和N477E）的Michaelis-Menten参数)，显示出对底物的亲和力增加和更高的周转率 (表1)。为了确认对文库L1的假设（FAD的紧密结合增加稳定性）在L3中是否仍然成立，作者测量了FAD对上述两个突变体的结合亲和力。结果发现，两种突变体与辅助因子的结合比野生型更紧密（表1），这支持了假设，并且两者之间没有显着差异。虽然无法确定G14A是否是导致亲和力增加的唯一突变，但可以得出的结论是，G14A的作用不会受到L3-4中其他七个突变（N336E、M400I、Q451K、T453A、V454E、Q473R和 N477E）的显着干扰。

随后使用分子动力学来阐明由大多数稳定突变体中的突变引起的结构变化导致对FAD更高亲和力的原因。模拟在CHMOwt的同源模型上进行（图3），包括以下突变体：L1-1 (G14A)、G14R（G14库中的另一个活跃突变体）和G14T（无活性突变体）。模拟结果表明在任何突变体中突变区域上的主链或侧链方向没有显着差异。突变区域的预测波动很小（~0.6 Å）并且突变体之间没有显着差异。对于野生型和突变体G14T，模拟结果显示定位FAD的腺苷与其原始位置分离，且G14T比突变体G14A和G14R的波动明显更大（图3）。该结果表明全酶G14A-FAD和G14R-FAD 比野生型或G14T更具刚性。结构分析表明，残基14的侧链与FAD辅因子非常接近，但指向远离它，所以侧链和FAD之间没有直接相互作用，观察到的稳定性可能是通过与相邻氨基酸更复杂的相互作用来实现的。两种截然不同的氨基酸（丙氨酸和精氨酸）都导致酶活性增加支持了这一解释。

通过引入结合理性和结构指导的共识原则设计的突变，作者增加了CHMOAcineto的热力学（ 5°C Tm）和动力学稳定性（8倍半衰期）和活性（1.5-2.5倍）。结构的变化对底物范围或区域和对映选择性没有明显影响。通过设计引入的单个突变使对辅因子FAD的亲和力增加了 11 倍——这一增加与后来引入的其他突变一致。本研究的结果表明，来自不动杆菌的模型 BVMO 环己酮单加氧酶可以在保持其催化活性和底物混杂性的同时得到稳定。