elisa捕获法的操作原理图（竞争抑制ELISA标准曲线的拟合方法）

众所周知，对于具有多个表位的抗原而言，双夹心 ELISA（Double Sandwich ELISA）可应用于目标抗原或抗体的定量检测。而对于小分子抗原或半抗原，因缺 乏可作夹心法的两个以上的结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定。此时， 可以采用竞争抑制法模式来检测其中靶分子的含量。竞争抑制 ELISA 又叫封闭 ELISA，其主要原理是将标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。 标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅，也就 是说，最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。小分子激素、药物 等 ELISA 测定多用此法。

对于很多习惯了双夹心法ELISA检测的实验人员而言，在面对竞争抑制ELISA 数据时常常会遇到不知如何分析的问题，上次我们已就经典的双夹心 ELISA 标准 曲线的绘制和拟合进行了详细讲解（双夹心法标准曲线的拟合方法），因此，接下 来我们将以 Cloud. Clone 公司的 CEA924Ge，氰钴胺素(CNCbl)检测试剂盒的一次 质检标准品吸光度值为例，详细地介绍一下用 EXCEL 软件进行竞争抑制 ELISA 标 准曲线的拟合步骤。

如图 1 所示，实验人员从最高 10000 pg/mL 浓度的标准品（第 F1 孔），经倍 比稀释至 123.5 pg/mL 浓度（第 B1 孔），阴性对照孔为单独的标准品稀释液（第 A1 孔），可以看出对于竞争抑制 ELISA 法来说，一般而言阴性对照孔的吸光度值 最大。

与双夹心法 ELISA 不同的是，竞争抑制 ELISA 的标准品吸光度值并不需要减 去阴性对照孔的本底吸光度值。以标准品的各孔吸光度值为 x 轴，标准品相应浓度 取 Log10 后的值(如图 2 所示的绿色突出显示部分)为 y 轴作 XY 散点图，得到一条 5 点曲线，其中 X 轴为吸光度（Optical Density），Y 轴为浓度的对数值（Log. of Concentration），如图 3 所示。

接着，在该曲线中任选一点以右键打开，选择”添加趋势线(R)”，图表上便 会弹出一个对话框。在“类型”选项中选择“多项式(P)”并将“阶数(P)”设定为 2 阶。最后，在“选项”中勾选“显示公式(E)”和“显示 R 平方值(R)”（如图 4 及图 5 所示），点确定，便会出现标准曲线的对应公式及 R2 值（如图 6 所示）。

图 3 标准曲线示例图

图 4. 添加拟合公式的过程示意图

图 5 典型带拟合公式的标准曲线示意图

在了解了竞争抑制 ELISA 标准曲线的绘制方法之后，我们如何判断一条标准 曲线是否良好呢？一般而言，合格的竞争抑制 ELISA 标准曲线应具备以下三点：

1. 标准品浓度越高，则得到的吸光度值越低，即样品中分析物浓度与吸光度 呈负相关；

2. R2值应至少大于 0.95，并且越接近 1 越好；

3. 阴性对照孔的吸光度值应大于 0.8。

接下来，我们将绘制和分析竞争抑制 ELISA 标准曲线过程中常见的问题及相 应的解决方案总结如下：

表 1. 竞争抑制 ELISA 标准曲线的常见问题及解决方案