植酸酶的检验方法（BioresourceTechnology多酶在可逆可溶聚合物上的共固定化级联催化玉米秸秆一锅法转化葡萄糖酸）

今天推送的文章发表在Bioresource Technology上的“Co-immobilization of multi-enzyme on reversibly soluble polymers in cascade catalysis for the one-pot conversion of gluconic acid from corn straw”，通讯作者为吉林农业大学生命科学学院的陈光教授。

木质纤维素是一种可直接转化为液体燃料和化学品的可再生资源。在现有的可重复利用的木质纤维素材料中，玉米秸秆是一种没有得到很好利用的丰富资源。在此背景下，如何将玉米秸秆中的纤维素转化为高附加值产品一直是人们研究的重点。葡萄糖酸是一种多功能有机化工产品，其盐类广泛应用于制药、农业、食品、医药等行业。据报道，木质纤维素原料中的纤维素氧化是生产葡萄糖酸的最有前途的途径之一。然而，目前使用贵金属(如Ti、Cu)催化剂催化纤维素生产葡萄糖酸受到阻碍，因为其能耗高、反应条件苛刻和环境污染。因此，对于纤维素氧化法生产葡萄糖酸来说，开发节能路线仍然是一项非常迫切但具有挑战性的任务。相比之下，生物催化法生产葡萄糖酸具有能耗低、无污染、产品易分离等优点。

本工作的目的是证明利用纤维素酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶在可逆可溶聚合物上一锅转化纤维素为葡萄糖酸的可行性。在本设计中，纤维素酶与β-葡萄糖苷酶相结合，首先将玉米秸秆纤维素水解成葡萄糖残渣，然后在葡萄糖氧化酶的催化下将葡萄糖转化为葡萄糖酸。利用过氧化氢酶的降解活性来降低葡萄糖氧化反应过程中产生的过氧化氢对葡萄糖氧化酶活性的抑制作用(图1a)。在此基础上，在Eudradit L-100上固定化多种酶，构建了玉米秸秆纤维素一锅转化为葡萄糖酸的人工反应体系。采用共价键合的方法，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为交联剂(图1b)，共固定化纤维素酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。在确定固定化酶制备条件的基础上，对固定化酶的酶学性质进行了表征。以玉米秸秆为底物，研究了玉米秸秆纤维素在人工体系中转化为葡萄糖酸的最佳条件。

Eudradit L-100的形态和质构特性

未改性的Eudradit L-100共聚物形态排列紧密，分布均匀，表面圆整光滑，呈球形，直径在10~60 µm之间。用Eudragit L-100载体对三种酶进行共价改性后，共聚物变得高度均一，蛋白膜表面粗糙、空洞。这是由于Eudradit L-100载体与蛋白质酶分子发生共价交联，导致共聚物分子与蛋白质分子之间有很强的结合力。在冷冻干燥过程中，蛋白质分子相互作用，在蛋白质表面形成膜和孔。该共聚物嵌入到蛋白质分子中，分布相对均匀，呈现出新的形态特征。对共固定化前后Eudradit L-100载体的BET比表面积和BJH孔径分布进行了分析。未改性的Eudradit L-100的比表面积为67.78 m²/g。固定化后比表面积降至20.73 m²/g，总孔容由0.0304 cm³/g降至0.0172 cm³/g。与未经修饰的Eudradit L-100相比，固定化后的Eudradit L-100的孔隙率发生了这些变化，表明该酶成功地进行了体外固定化。

游离酶比例的优化

为提高固定化多酶体系的催化效率，对各酶的配比进行了优化。首先以葡萄糖为底物，以葡萄糖酸得率为指标确定葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的最佳配比。观察到葡萄糖酸转化率随着葡萄糖氧化酶活性的降低而降低(表1)。当葡萄糖氧化酶含量较低，过氧化氢酶含量较高时，所得葡萄糖酸含量明显增加，说明葡萄糖氧化过程中产生的H₂O₂对葡萄糖氧化酶活性有明显的抑制作用。因此，确定葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的最佳配比为1：10。随后，以预处理过的玉米秸秆为底物，以葡萄糖酸产量为指标，确定了纤维素酶与葡萄糖氧化酶：过氧化氢酶的最佳配比。如表1所示，当葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的最佳比例设定在一个固定的值(以X表示)时，随着纤维素酶：X比的降低(从10：X降低到1：X)，葡萄糖酸的产率显著降低。此外，当X：纤维素酶的比例从1：X增加到1：10X时，葡萄糖酸的产率没有明显提高。这表明纤维素酶的纤维素水解效率对纤维素向葡萄糖酸的转化有很大影响。因此，当纤维素酶：葡萄糖氧化酶：过氧化氢酶的酶活比为10：1：10时，葡萄糖酸的转化率最高。

共固定化酶配比的优化

根据以游离酶为基础确定的最适酶活比，纤维素酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶在Eudradit L-100固定化过程中的添加量分别为10 U、1 U和10 U。根据固定化后测得的酶蛋白含量，三种酶的固定化效率分别为58.11%、90.72%和27.40%(表2)。根据最佳酶活比适量添加酶后，固定化效率分别提高到72.85%、96.33%和42.26%。纤维素酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的固定化酶回收率分别为53.23%、89.05%和31.20%。优化酶量后，酶活回收率分别提高到57.65%、93.96%和38.84%。结果表明，优化加酶量后，载体上的酶负载量增加，固定化效率提高，酶活回收率随固定化酶加入量的增加而提高。因此，经过优化后，纤维素酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的实际活力分别为17.20 U、1.10 U和36.49 U。

共固定化酶和游离酶的最适pH及其稳定性

催化环境中的pH对酶催化反应有显著影响。固定化后，最适pH范围可能会发生一定程度的变化。本研究以纤维素酶和葡萄糖氧化酶活性为指标，测定了共固定化酶的最适pH和pH稳定性，并与游离酶进行了比较。以pNPC为底物测定纤维素酶活力时，游离纤维素酶和固定化酶的最适pH分别为5.0和5.5(图2a)。与游离酶相比，共固定化酶的最适pH范围增大，在pH7.5时酶活保持在50%以上。以1.0%葡萄糖为底物测定葡萄糖氧化酶活性时，共固定化酶和游离酶催化反应的最适pH均为6.0(图2b)。但是，与游离葡萄糖氧化酶相比，共固定化酶在pH为5.5~6.5时仍能保持较高的酶活力。由于固定化纤维素酶的最适pH为5.5，在pH 5.5时固定化葡萄糖氧化酶的最大活性保持在98.89%，因此确定了共固定化酶催化反应的最适pH为5.5。

随后对固定化酶的pH稳定性进行了研究。固定化酶中纤维素酶活性在pH 5.0时损失最小 (图2c)。48 h后，固定化酶活性维持在64.71%。游离纤维素酶在pH 7.0时能保持最大活力，48 h后酶活力保持在52.24%。固定化酶在pH 5.0时表现出最高的纤维素酶活力。该酶在pH 5.0~7.0范围内活性稳定，在pH 8.0~9.0范围内有明显的活性损失。结果表明，在相似条件下，固定化酶表现出较好的性能。游离葡萄糖氧化酶在pH 5.0时活力损失最小，48h后酶活回收率为68.12%(图2d)。而固定化酶在pH 6.0时酶活损失最小，保持了74.34%的初始酶活。

共固定化酶和游离酶的最适温度和热稳定性

分别以pNPC和葡萄糖为纤维素酶和葡萄糖氧化酶的底物，研究了固定化前后酶在单一生物催化反应中的性能。如图3a所示，共固定化酶的纤维素酶活力在45-55 ℃时显著提高，最适温度为55 ℃。低温下游离纤维素酶的活力明显低于共固定化酶，且随着温度的升高(>50 ℃)，酶活力迅速下降。以1.0%葡萄糖为底物时，游离葡萄糖氧化酶和共固定化酶的最适温度分别为50 ℃和60 ℃(图3b)。在最适温度下，尽管游离葡萄糖氧化酶活性高于共固定化酶，但随着温度的进一步升高，其活性显著降低。最后确定了固定化酶后续催化的最适温度为55 ℃。

共固定化酶在55 ℃时24 h保持了80%的初始活力，48 h后仍保持了70%以上的活力(图3c)。但随着培养时间的延长，游离纤维素酶活性显著降低。48 h后，仅保持了39%的初始活性。此外，游离葡萄糖氧化酶的剩余活力不到初始活力的40%，而共固定化酶在48 h后仍保持在50%以上的活力(图3d)。

共固定化酶的可重复使用性

固定化酶催化一次后，酶活力保持在91.86%，重复使用6次，固定化酶活力回收率为52.38%，具有潜在的重复使用潜力(图4)。

响应面法优化反应参数

在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken析因设计，以葡萄糖酸的得率为反应指标，对反应条件进行了优化。选择A(温度：50、55和60 ℃)、B(pH：5、5.5和6)、C(酶活：1.434、2.152和2.860 U)作为自变量，以Y(葡萄糖酸得率)作为响应值。不同因素和水平下的产品浓度响应表面值如表3所示。使用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行拟合，确定二次多项式回归方程。模型的可信度分析如表4所示。决定系数(R²)为0.9850，接近1，说明试验预测值的一致性。修正系数R²_Adj为0.9657，表明该模型能解释96.57%的响应值变化，模型拟合度较高，检验误差最小。F值为51.07(P<0.0001)，表明所建模型有显著性差异。模型的Prob>F值为0.1895，表明回归方程能够反映自变量与因变量之间的关系。通过比较回归方程中主项系数的绝对值和回归系数的可检验性，可以评估实验因素对葡萄糖酸产量的主次效应。如表4所示，3个因素对葡萄糖酸浓度的影响大小顺序为：酶活力>温度>pH。证实了pH对葡萄糖酸产量的影响最小，因为多个酶与载体共价结合后，共固定化酶的pH耐受性增强，从而降低了pH的影响。利用残差提供的数据考察了模型的合理性和可靠性。残差的正态分布如图5a所示。实测值与预测值基本一致，说明残差服从正态分布。

三维响应曲面图显示了各因素对产量的影响。温度和pH对葡萄糖酸产量的影响如图5b所示。结果表明，在最适pH条件下，温度越高，葡萄糖酸的产率越高。在最适pH下，温度在53~58 ℃时，因变量最大。温度和酶活性对葡萄糖酸产量的影响如图5c所示。在较低的酶浓度下，葡萄糖酸的产率随温度的降低而增加。然而，在酶活性较高的情况下，葡萄糖酸的浓度随着温度的升高而增加。图5d显示了pH和酶活性对葡萄糖酸产量的影响。由于固定化后酶的pH稳定性提高，使葡萄糖酸的产量受到轻微的抑制。此外，在最适pH条件下，酶活力降低时，因变量表现出较高的值。

模型预测与验证

优化结果表明，葡萄糖酸的最佳生产条件为：温度53.76 ℃，pH 5.56，酶活1.73 U，预测葡萄糖酸的产量为0.2632 mg/mg。在此条件下，对基于响应面方法的预测结果进行了验证。结果表明，优化后葡萄糖酸的产率达到0.2820 mg/mg，比预测值提高了7.14%，验证了响应面优化结果的可靠性和实用性。玉米秸秆纤维素的转化效率按方法部分的公式计算。响应面优化后玉米秸秆纤维素转化率为61.41%(0.2820 mg/mg/0.4137/1.11x100)。

本研究采用多酶共固定化技术，在可逆可溶性Eudradit L-100载体上成功固定化了三种酶，实现了玉米秸秆一锅法转化葡萄糖酸。通过对共固定化酶的制备条件、酶学性质和催化条件的确定，将其应用于催化反应。在最佳工艺条件下，葡萄糖酸的产率为0.28 mg/mg，玉米秸秆纤维素转化为葡萄糖酸的转化率为61.41%。共固定化酶重复使用6次后，活力保持在52.38%。结果表明，在复合级联反应中采用可逆可溶性载体的多酶固定化策略是可行的。

整理：孙骁

文章信息：

PMID：33316703

DOI：10.1016/j.biortech.2020.124509

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852420317831#t0005