噬菌体条形码（通过噬菌体展示文库）

鸭甲型肝炎病毒（DHAV）是引起鸭病毒性肝炎（DHV）的主要病原体，威胁着全世界的养鸭业。近日，一则刊登在Viruses上的文章中，来自山东农业大学姜世金教授的科研团队从噬菌体展示肽库中分离出了新型肽1GLTWKLPPSM10，可模拟DHAV-1和-3的抗原表位，用这一新型肽免疫雏鸭，能够触发对DHAV的有效免疫反应并抑制体内病毒感染。

这项研究利用噬菌体展示技术鉴定DHAV的抗原模拟物，通过制备DHAV-1和DHAV-3的单克隆抗体（mAb）4E6，并用mAb筛选了用PhD-12噬菌体展示肽库试剂盒制备的噬菌体文库。一种新的多肽被鉴定为与mAb高度亲和力的多肽，能够特异性地阻断mAb 4E6与DHAV-1和DHAV-3的结合。动物试验证实，用模拟表位免疫雏鸭，能够触发对DHAV的有效免疫反应并抑制体内病毒感染。

噬菌体展示技术是一种体外筛选蛋白质和其他大分子配体的技术，是蛋白质相互作用研究的重要工具。噬菌体展示库由大量噬菌体组成，可在噬菌体外壳蛋白中表达外源肽或蛋白质序列。在先前的研究中，研究人员制备了一个与DHAV-1和DHAV-3高度亲和的单克隆抗体（mAb） 4E6。在本研究中，首先进行了mAb 4E6抗DHAV-1和DHAV-3的中和试验，发现mAb 4E6以42.2稀释倍的中和效价中和了DHAV-1 LY0801菌株，而以22.6稀释倍的中和效价中和了DHAV-3 SD1201菌株，表明DHAV-1是mAb 4E6所识别的主要血清型。而后证实了4E6识别的表位位于DHAV-1和DHAV-3的VP1蛋白。

为了确定mAb 4E6识别的表位，通过三轮噬菌体展示，获得了与mAb结合的噬菌体。第三轮生物淘选后，随机选择30个噬菌体克隆，用ELISA法检测其与mAb 4E6的反应性，有17个噬菌体克隆与mAb 4E6呈特异性反应，通过对这些噬菌体克隆进行测序，发现其中15个克隆含有1GLTWKLPPSMVH12序列，序列命名为Pep0，而其余两个序列中的一个，1IGENITNPIKPN12，被命名为PepN。

合成的Pep0是否能阻止mAb 4E6与病毒DHAV-1和DHAV-3结合呢？研究人员采用竞争性ELISA检测结果表明，合成抗原肽Pep0可明显抑制mAb 4E6与DHAV颗粒的反应，且呈剂量依赖性。此外，Pep0可以抑制mAb 4E6与1VP1-Sf9表达的裂解物和3VP1-Sf9表达的裂解物的反应，进一步表明1GLTWKLPPSMVH12是VP1的抗原模拟物。

作者分别合成Pep0和PepN并与载体蛋白KLH偶联，对合成肽在家兔体内的免疫原性进行了评价。三次免疫后，竞争性ELISA结果显示：Pep0-KLH免疫的兔子产生了特异性多肽抗体，兔血清中的抗体可以与DHAV-1和DHAV-3发生交叉反应。作者进一步评估了Pep0对DHAV感染的影响，结果表明：Pep0以剂量依赖的方式阻断了DHAV-1和DHAV-3感染，而PepN的等效浓度对DHAV-1和DHAV-3感染没有影响。

为研究Pep0中到底哪些氨基酸发挥关键作用，研究人员设计并合成了各种片段，通过斑点杂交和western blotting结果表明：N-末端缺失Pep0的氨基酸12H或11V12H并不影响与mAb 4E6和抗Pep0血清的肽结合，但在C-末端缺失氨基酸1G或N-末端缺失10M11V12H完全消除了与抗Pep0血清的肽结合。这些结果表明，1GLTWKLPPSM10是与抗Pep0兔血清反应的表位的基本序列，被命名为Pep1。

为验证Pep1的免疫效果，作者对Pep1的片段进行了合成并与KLH偶联，分别在第1天和第7天用Pep1-KLH对雏鸭进行两次免疫，在第10天进行攻毒。结果表明：用Pep1-KLH免疫的鸭在第10天产生了抗DHAV特异性抗体。病毒感染后5天内，在血清中检测到抗DHAV-1和DHAV-3强特异性抗体，Pep1-KLH免疫组的存活率为81.1%，而PepN-KLH免疫组的存活率为13.3%。Pep1-KLH免疫组活雏鸭肝脏中DHAV-1和DHAV-3的病毒载量显著低于PepN-KLH免疫组死雏鸭肝脏中的病毒载量。这些结果表明，用Pep1免疫雏鸭可以抑制DHAV-1和DHAV-3的复制，保护雏鸭免受DVH的侵袭。

这是首次鉴定DHAV‐1和DHAV‐3的VP1蛋白中的交叉反应模拟物的研究。作为DHAV的中和构象模拟表位，1GLTWKLPPSM10表位将为开发抗DHAV感染的新型疫苗提供新的思路。

参考文献：Ruihua Zhang, Yupeng Yang, Jingjing Lan, et al. A Novel Peptide Isolated from a Phage Display Peptide Library Modeling Antigenic Epitope of DHAV-1 and DHAV-3. 2020, 8(1)