多倍体单细胞测序（单细胞核糖体测序技术）

导 读

当前，单细胞测序方法使得深入分析细胞类型和细胞状态的多样性成为可能，大部分的研究将侧重点专注于单个细胞的基因组、表观基因组和转录组。最近单细胞分辨率的质谱检测使得单细胞在蛋白质组学方面取得了进展，但在单个细胞中检测翻译事件仍具有较大的挑战。

近日，荷兰乌得勒支大学医学中心的研究团队在国际顶尖期刊Nature在线发表了题为“Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing”的文章。研究证明，单细胞核糖体测序技术（scRibo-seq）能够实现单密码子的分辨率；极大提高了单细胞核糖体检测的敏感性，使得在单个细胞中对核糖体进行分析成为可能。此外，研究团队还证明，对特定氨基酸的限制会导致核糖体在编码氨基酸的密码子的子集上出现暂停，并且这种现象只在与其细胞周期状态相关的细胞亚群中被观察到。总之，这项技术为确定翻译过程以及对那些看似相同的细胞之间的显著差异的解析提供了近一步的证据。

文章发表在Nature

主要研究内容

scRibo-seq可用于单细胞翻译状态的解析

scRibo-seq技术结合了核酸酶足迹与小RNA文库的构建、富集来测量单个细胞中的翻译动态。研究团队将这些过程整合到一个反应体系中，发现其能够显著提高现有核糖体分析技术的敏感性和可扩展性。具体操作步骤包括：1）单个活细胞被分选到含有环己亚胺的裂解缓冲液中，以稳定和停止转录本上的核糖体；2）暴露的RNA被微球菌核酸酶（MNase）消化，由此产生的核糖体保护足迹（RPFs）被释放；3）这些印迹通过连接包含独特分子标识符（UMI）和引物位点的adapter而转化为测序库，用于后续的cDNA合成和PCR：4）最后选择尺寸合适的聚合反应产物，以富集符合典型RPF长度的片段进行测序。

图1. scRibo-seq流程示意图。图片来源：Nature

为了验证该方法，研究人员首先从HEK 293T和hTERT RPE-1细胞系入手，由此产生的单细胞核糖体文库每个细胞可检测约3,348个基因，共有10,451个独特的reads。随后通过生物信息学分析发现，这些片段能够映射到编码序列 (coding sequences, CDSs)，它们的5 ʹ末端在起始密码子上游大约15个核苷酸位置显著富集，在终止密码子上游大约18个核苷酸位置显著减少；起始密码子和终止密码子的局部密度均有增加；reads的5ʹ端沿CDS显示了一个清晰但适中的3个核苷酸的周期性。

图1. scRibo-seq流程示意图。图片来源：Nature

基于单细胞翻译状态的异质性

为了进一步验证scRibo-seq测得的翻译动力学，研究团队去除了HEK 293T培养基中的精氨酸和亮氨酸，并在3和6小时后对E、P和A位点密码子占位的变化进行了分析，观察到处理后特异性的停顿现象。

图3. 氨基酸限制下的核糖体功能暂停。图片来源：Nature

值得注意的是，在每种限制条件下，只有一部分细胞表现出暂停反应。利用每CDS的RPF计数对细胞进行聚类，可以通过细胞周期标记基因识别出四个群体。在这些群体的基础上，研究人员发现细胞周期状态、氨基酸限制对翻译暂停存在显著影响。

核糖体在单个基因上的停顿位置在单细胞核糖体测序数据中也很明显。例如，H3C2是在精氨酸缺乏下CGC暂停增加的基因之一，通过检测H3C2上的RPF密度，发现了几个暂停热点。这些区域中最显著的是两个连续的CGC密码子，这可能解释了与该转录本上其他相同密码子相比，该位置的密度增加的原因。

图4. 基于单细胞核糖体测序的异质性分析。图片来源：Nature

翻译调控与细胞周期

翻译调控是一种重要的细胞周期调控机制，但前期的研究仅仅粗略地解决了细胞周期的主要状态，并依赖于用同样作用于翻译机制的方法捕获或同步细胞。在观察到细胞周期状态会影响对氨基酸限制的响应后，研究团队检测了未受干扰的细胞周期中是否会改变翻译特性。

研究人员从3,276个表达荧光泛素化细胞周期指标 (FUCCI) 的单个hTERT-RPE-1细胞中得到了单细胞核糖体测序数据，这些细胞包括了不同的细胞周期状态。利用每CDS的RPF计数对单个细胞进行聚类，确定了8个群体。随后，通过伪时序分析进一步解决了细胞周期中的这一进程，并建立了与FUCCI标记相似的轨迹。此外，通过深入分析，研究人员还鉴定了1,853个在翻译动态中存在显著差异的基因。

图5. 基于单细胞核糖体测序的细胞周期分析。图片来源：Nature

在细胞周期中出现频率变化的密码子中，有丝分裂细胞中A位点占位增加 (GAA、GAG和AUA) 或减少 (CGA) 的密码子有4个，其余活性位点保持不变。其中，A位点的停顿比GAA位点的增加更为明显，且具有阶段特异性。

此外，这些A位点暂停的变化是全局的，并且影响了大多数翻译基因。通过比较每个群体和背景之间RPFA位点GAA密码子的基因频率，研究人员发现大多数基因在有丝分裂期间都经历了GAA暂停的增加。这些A位点暂停的阶段性变化可能反映了有丝分裂期间翻译伸长动力学的全局变化。

图6. 细胞周期中的翻译暂停。图片来源：Nature

结 语

上述研究结果表明了scRibo-seq在测量单细胞尺度下翻译状态的可行性，填补了现有单细胞基因组学维度的关键空白。此外，scRibo-seq还提供了一种无标记和无转基因的核糖体分析方法，其灵敏度和分辨率可测量单个细胞群体中特定转录本上的核糖体行为，分辨率可达到单个密码子。这些独特的优势使科研人员能够详细地检测哺乳动物细胞周期中的翻译，并为有丝分裂期间翻译调节的广泛改变提供了证据。

参考文献:

1.VanInsberghe, M., van den Berg, J., Andersson-Rolf, A. et al. Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing. Nature (2021).

2.Darnell, A. M., Subramaniam, A. R. & O'Shea, E. K. Translational control through differential ribosome pausing during amino acid limitation in mammalian cells. Mol. Cell 71, 229–243.e11 (2018).

3.Martinez, T. F. et al. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nat. Chem. Biol. 16, 458–468 (2020).