两个缓冲液曲线的值不一样怎么办？从pKa到流动相pH的科学选择

前面介绍了pKa相关的基本概念和常见类型化合物的数据[从pKa到流动相pH的科学选择（一）：基本概念和pKa的确定或预测]，今天接着来介绍缓冲液。

基本概念

缓冲液（Buffer）：指由一种共轭的质子给体和质子受体构成的可离子化合物的溶液，它可以在加入少量酸或碱时维持溶液pH稳定的作用。常用缓冲液溶质的pKa数据如下：

缓冲液的作用主要有两个方面：

（1）缓冲分析物，使其保持在所需的pH值处。由于在实际分析工作中，色谱柱上的样品质量非常少，因此仅需要很少的缓冲液就能为样品提供足够的缓冲。如果样品与流动相的pH值相差大，且进样量太大，建议在进样前先调节样品溶液至接近流动相pH值。

（2）缓冲色谱柱，使其保持恒定的pH值。由于大量的缓冲流动相通过色谱柱，所以固定相不断暴露在缓冲液中。随着现在商品化的硅胶基质色谱柱纯度的提高，硅胶上的酸性硅醇基团的含量也越来越低，因此所需的缓冲液也越来越少。下图是高纯、中等纯和低纯硅胶的柱子在添加0.1%和增加0.01%TFA时分析图谱对比：

缓冲能力（Buffer Capacity）：它取决于两个因素：

（1）缓冲液的浓度。下图就是醋酸盐在5 MM，10 mM，20 mM和40 mM浓度下的缓冲容量，可以看到它往往在它的pKa，即pH 4.75处呈现最大的缓冲能力，而且随着浓度增加，缓冲能力也增加。

因此为了获得足够的缓冲能力，一般需要适当浓度的缓冲液。推荐的最终溶液中，对于酸性添加剂一般在0.1% v/v左右，或者至少含有5-10 mM的缓冲液。一般来说，对于大多数的应用，10-25 mM的添加剂已经足够，但是最好根据具体情况确定。

（2）溶液的pH和缓冲盐pKa的差值。不同的缓冲液一般有不同的缓冲范围，一般来说，在其pKa值上下浮动1个pH单位内使用时，缓冲液是最有效的；在pKa值上下浮动2个单位内时，也可以提供足够的缓冲。因此从上表中就可以得到缓冲液对应的缓冲范围。

有机溶剂存在下的pKa和pH的变化

文献中缓冲盐的pH和pKa以及分析物的pKa数据很多是在水中测定，但是pH和pKa都会随着有机溶剂的加入而发生改变。一般来说随着有机溶剂的加入，酸的pKa变大，而碱的pKa变小。虽然有这些变化，缓冲液的缓冲能力并不会因为有机溶剂的加入而发生变化。因此在配置缓冲液的时候，强烈建议在加入有机溶剂之前调节pH值至目标值，当加入有溶剂后，溶液pH会发生变化，但是此时无需再调节。另外，为防止混合过程中缓冲盐发生析出，务必将有机相加入水相，而不是将水相加入有机相。

常用缓冲盐点评

磷酸盐：是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，因为它可以在低于220 nm的波长下使用。磷酸盐具有三个pKa值，可提供pH 1.1-3.1，6.2-8.2，11.3-13.3三个缓冲范围，。虽然它使用广泛，但是也要注意它的溶解度问题，防止高浓度条件下在HPLC泵或者色谱柱中析出。

醋酸盐：也是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，可以在低于220 nm的波长下使用。它可以提供pH 3.8-5.8的缓冲范围，因此它刚好填补了磷酸盐在pH 2.0-8.0之间的缺口。

因此磷酸盐和醋酸盐的配合使用可以满足通常用于硅胶基质色谱柱的整个pH范围。

三氟乙酸：0.1%的三氟乙酸能产生pH≈2的流动相，多年来它一直是低pH条件下LC-MS的首选添加剂，但是TFA能够抑制电离，导致信号下降。TFA也可作为离子对试剂，广泛用于蛋白和多肽类的分析。

甲酸：0.1%的甲酸能产生pH≈2.7的流动相，已经成为低pH条件下LC-MS的首选。

总结

本篇围绕缓冲液展开，重点介绍了缓冲液的性质和基本数据、有机相对缓冲液性质的改变，也对常用缓冲盐进行了点评，希望有助于大家在开发或者优化HPLC方法时选择合适的缓冲液。

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参考文献

1. Stavros Kromidas, HPLC Made to Measure, 2006, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

2. L. R. Snyder, J. J. Kirland, Introduction to Modern Liquid Chromatography 3rd. 2010, John Wiley & Sons, Inc.

3. Eric V. Anslyn, Dennis A. Dougherty. Modern Physical Organic Chemistry, 2006, University Science Books

4. John Dolan, A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection, www.ace-hplc.com