pcr技术使用方法(PCR技术介绍)

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术,是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术。PCR技术操作简便,可在短时间获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明,引起了生物技术发展的一次革命,目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。

PCR反应的几个要素

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PCR反应步骤

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PCR反应条件

PCR反应成分

1. 模板

模板可以是DNA,也可以是RNA(反转录PCR),既可以是双链,也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

2. Taq DNA聚合酶(Taq酶)

DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等存在的情况下催化DNA的合成。Taq酶来自水生嗜热菌

3. 引物

引物浓度:0.1-0.5 umol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。

引物设计:

(1)引物序列特异性好,与非扩增区无同源性。

(2)引物长度以15-40 bp为宜。

(3)碱基尽可能随机分布,G C占40-60%。

(4)引物Tm在50℃-65℃之间,两条引物的Tm应接近,不能相差太大。

(5)引物内部避免形成二级结构。

(6)两引物间避免有互补序列。

(7)引物3’端与模板序列要严格配对,3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ;引物 5’端无严格限制。

4. dNTP

dNTP:dATP, dTTP, dGTP, dCTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度

四种dNTP浓度应相等

浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2 结合,使游离的Mg2 浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。

5. Mg2

Mg2 是DNA聚合酶的激活剂。Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2 过高影响反应特异性。Mg2 可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度。

6. 缓冲液(Buffer)

10mmol/L TrisHCl 调节PH,使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性(pH8.3,室温)

50mmol/L KCL 有利于引物的退火,但过高会抑制Taq酶活性

0.01% 明胶 保护酶不变性失活

7. 延伸

70-75℃(温度取决于聚合酶的活性)

延伸时间由扩增片段长度及DNA

聚合酶的延伸速度决定

3.1.8循环次数

主要取决于模版DNA的浓度

一般为25-35次

次数过多:扩增效率降低

错误掺入率增加

PCR常见问题

1. 无扩增产物

现象:正对照有条带,而样品则无。

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2. 非特异性扩增现象:

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

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3. 拖尾

现象:产物在凝胶上呈Smear状态

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4. 假阳性(筛选转基因、检测基因表达情况)

现象:空白对照出现目的扩增产物

原因:靶序列或扩增产物的交叉污染

对策:

(1) 操作时小心轻揉,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外

(2) 除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用

(3) 各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存

注意的事项

(一)防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开,无菌操作

(二)设立对照

阳性对照:阳性模板

阴性对照:阴性模板

试剂对照:除模板外的所有组分

PCR的不同类型

1. 重组PCR

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2. 反向PCR

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3. 多重PCR

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4. 递减PCR(TouchDown PCR)

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP、DNA指纹分析等。6.5 热启动PCR (HotStart PCR)

热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度;该酶具有热启动的性能,使用简单方便,适合于高通量应用;热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。

5. RT-PCR

RNA的多聚酶反应(RT-PCR)是以RNA 为模板,联合逆转录反应(reverse transcription,RT)与PCR,可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增步骤: 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下,合成RNA的互补cDNA加热后cDNA与RNA链解离,然后与另一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA,最后扩增靶DNA

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一步法:

利用同一缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度,临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。

两步法:

由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰,常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因,及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行,这样使得两个反应充分发挥各自的特点,更为灵活而且严谨,适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板,以及多个基因的RT-PCR。

  • 作者:海星生物
  • 公众号:Cas9X细胞基因编辑
  • 以上内容由海星生物(http://www.cas9x.com)提供
  • 服务内容:CRISPR/Cas9细胞基因编辑 载体构建/病毒包装 PDO/动物模型CDX 稳转细胞株 干细胞/原代细胞 培养试剂盒

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