pcr技术使用方法（PCR技术介绍）

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。

PCR反应的几个要素

PCR反应步骤

PCR反应条件

PCR反应成分

1. 模板

模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR），既可以是双链，也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

2. Taq DNA聚合酶（Taq酶）

DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等存在的情况下催化DNA的合成。Taq酶来自水生嗜热菌

3. 引物

引物浓度：0.1-0.5 umol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。

引物设计：

（1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。

（2）引物长度以15-40 bp为宜。

（3）碱基尽可能随机分布，G C占40-60%。

（4）引物Tm在50℃-65℃之间，两条引物的Tm应接近，不能相差太大。

（5）引物内部避免形成二级结构。

（6）两引物间避免有互补序列。

（7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限制。

4. dNTP

dNTP：dATP， dTTP， dGTP， dCTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度

四种dNTP浓度应相等

浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2 结合，使游离的Mg2 浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。

5. Mg2

Mg2 是DNA聚合酶的激活剂。Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2 过高影响反应特异性。Mg2 可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度。

6. 缓冲液（Buffer）

10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）

50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性

0.01% 明胶 保护酶不变性失活

7. 延伸

70-75℃(温度取决于聚合酶的活性）

延伸时间由扩增片段长度及DNA

聚合酶的延伸速度决定

3.1.8循环次数

主要取决于模版DNA的浓度

一般为25-35次

次数过多：扩增效率降低

错误掺入率增加

PCR常见问题

1. 无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无。

2. 非特异性扩增现象：

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

3. 拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态

4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

对策：

(1) 操作时小心轻揉，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外

(2) 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用

(3) 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存

注意的事项

（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作

（二）设立对照

阳性对照：阳性模板

阴性对照：阴性模板

试剂对照：除模板外的所有组分

PCR的不同类型

1. 重组PCR

2. 反向PCR

3. 多重PCR

4. 递减PCR（TouchDown PCR）

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。6.5 热启动PCR （HotStart PCR）

热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

5. RT-PCR

RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA 为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA,最后扩增靶DNA

一步法：

利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。

两步法：

由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。

• 作者：海星生物
• 公众号：Cas9X细胞基因编辑
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