蛋白质等电点测定分析与讨论（蛋白质的等电点测定和沉淀反应）

一、实验目的

ü 了解蛋白质的两性解离性质

ü 学习测定蛋白质等电点的一种方法

ü 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识

ü 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义

ü 了解蛋白质变性与沉淀的关系

二、实验原理

v 蛋白质等电点测定

Ø 蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：

Ø 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点（PI）。

Ø 不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。我们测等电点最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值

Ø 本实验借观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液，向各缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点

v 蛋白质的沉淀与变性

Ø 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀

Ø 蛋白质的沉淀可分为两类：

（1）可逆的沉淀反应：蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质

（2）不可逆的沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应

ü 注意：蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性

v 沉淀蛋白质的方法

Ø 盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠或氯化钠），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中析出。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性，当除去盐后，即可溶解

Ø 重金属盐沉淀法：当溶液pH大于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，容易与重金属离子（Hg2 、Pb2 、Cu2 或Ag ）结合成不溶性盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再用催吐剂排出体外。

Ø 某些有机酸沉淀法：某些有机酸指的是三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。

Ø 有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。此法如果控制在低温下操作并且缩短处理时间，则可使变性速度减慢。

Ø 加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固，当蛋白质处于等电点时，加热变性凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点，也破坏了带电状态。古代人将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入大量盐卤（含MgCl2）制豆腐，便是此方法的成功应用。

三、实验器材

温度计，锥形瓶，恒温水浴锅，容量瓶，吸管，试管及试管架，乳钵

四、实验材料与试剂

Ø 0.4％酪蛋白醋酸钠溶液

Ø 1mol/L醋酸溶液

Ø 0.1mol/L醋酸溶液

Ø 0.01mol/L醋酸溶液

Ø 蛋白质溶液：5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液

Ø 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液

Ø 3％硝酸银溶液

Ø 5％三氯乙酸溶液

Ø 95％乙醇

Ø 饱和硫酸铵溶液

Ø 硫酸铵结晶粉末

Ø 0.1mol/L盐酸溶液

Ø 0.1mol/L氢氧化钠溶液

Ø 0.05mol/L碳酸钠溶液

Ø 甲基红溶液

五、实验操作

Ø 等电点的测定

§ 取同样规格的4支试管，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀

§ 振荡摇匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加8mL水，然后在第2、3号管中各加1滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成

§ 每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀是是否再溶解。解释各管发生的全部现象

六、实验思考

Ø 何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？

Ø 详细记录各实验的结果和现象，并解释这些现象。

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