新生儿坏死性小肠结肠炎考题（抑制miR-124可改善新生儿坏死性小肠结肠炎）

​文章信息

Inhibition of miR‐124 improves neonatal necrotizingenterocolitis via an MYPT1 and TLR9 signal regulation mechanism

Yiyu Yin，Zhenfang Qin，Xiaobing Xu，Xu Liu，Huaxin Zou，Xiaole Wu，Junhua Cao

DOI: 10.1002/jcp.27691

发表杂志：Journal of cellular physiology（IF=4）

1.研究背景

坏死性小肠结肠炎（NEC）是新生儿发病和死亡的主要原因之一。目标是检测NEC小肠组织中miR-124的机制。

2.方法

2.1 通过H＆E染色法检测大鼠NEC模型中受损组织的修复情况。

2.2 通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色评估肠组织中的细胞凋亡水平。

2.3 通过RT-PCR（Wcgene Biotech, Shanghai, China）检测miR‐124，Rho相关的卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1），肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1（MYPT1）以及NEC组织和IEC-6细胞中的Toll样受体9（TLR9）。

2.4 通过萤光素酶报告基因检测验证ROCK1是否是miR-124的直接靶标。

3.结果

3.1 miR-124在NEC组织上调，ROCK1和MYPT1在NEC组织下调

Western blot分析结果表明，ROCK1、MYPT1和p-mypt1在NEC组织中均比对照组织下调（图1A）；定量PCR（qPCR）结果证实，ROCK1和MYPT1在NEC组织中的RNA表达水平也受到抑制（图1b，C）。研究表明，ROCK1和MYPT1可被miR-124调节，并且在我们的NEC组织中检测到miR-124。

图1.miR-124在NEC组织中被上调，ROCK1和MYPT1在NEC组织中被下调。（a）NEC组织中ROCK1，MYPT1和p‐MYPT1的蛋白表达水平比正常组织下调。（b）NEPT组织中MYPT1的mRNA表达水平低于正常组织。（c）NEC组织中ROCK1的mRNA表达水平比正常组织下调。（d）miR-124在NEC中被上调。

3.2 大鼠NEC模型组织损伤和凋亡增加

H&E结果表明，NEC组织中的肠组织受到严重损伤，而在miR-124被抑制后，损伤被大量逆转（图2A）。TUNEL染色检测细胞凋亡。NEC组织中TUNEL阳性肠细胞明显增多。然而，TUNEL阳性肠细胞在MIR-124抑制剂组组织中很少出现（图2B）。

图2.大鼠NEC模型的组织损伤和凋亡增加。（a）NEC肠组织的H＆E染色结果。（b）NEC肠组织的TUNEL阳性肠细胞结果。

3.3 miR-124抑制增加了ROCK1，MYPT1和TLR9的表达

qPCR结果显示，当NEC组织中miR-124被抑制时，ROCK1、MYPT1和TLR9显著增加（图3A）。此外，Westernblot分析结果表明，miR-124抑制也促进了ROCK1、MYPT1和TLR9（图3B）。

图3.miR-124抑制增加了ROCK1，MYPT1和TLR9的表达（a）RT-PCR用于测量miR-124，ROCK1，MYPT1和TLR9的表达。（b）ROCK1，MYPT1，p‐MYPT1和TLR9的蛋白表达水平。

3.4 ROCK1是miR-124在NEC组织中的直接靶点

研究表明，miR-124可以通过结合ROCK1的3'-UTR区来调节ROCK1的转录活性。 Western blot分析的进一步研究表明，miR-124的过表达可以极大地抑制ROCK1的表达（图4b）。

图4.ROCK1是NEC组织中MI R-124的直接靶点。

3.5 过表达MYPT1可逆转miR-124的抑制作用

qPCR结果表明，miR-124的过表达可以明显抑制ROCK1，MYPT1和TLR9的表达，而抑制miR-124则可以显着增加ROCK1，MYPT1和TLR9的表达。然而，在miR-124抑制剂/ MYPT1组中，miR-124抑制剂的促进作用被MYPT1的过表达逆转（图5a）。同时，ROCK1，MYPT1和TLR9的蛋白表达水平也出现了相同的结果（图5b）。

图5.MYPT1的过表达逆转了miR-124的抑制作用。用miR-NC，miR-124模拟物，miR-124抑制剂和miR-124抑制剂/ MYPT1转染IEC-6细胞。（a）miR-124，ROCK1，MYPT1和TLR9的RT-PCR结果。（b）ROCK1，MYPT1，p‐MYPT1和TLR9的蛋白质印迹分析结果。

结论

miR-124是NEC的启动子，通过靶向ROCK1抑制TLR9表达来促进肠道细胞凋亡和炎性细胞浸润。