实时荧光定量pcr原理和结果分析（实时荧光定量PCR实验操作流程）

一、实验器材及试剂1、 实验器材，今天小编就来聊一聊关于实时荧光定量pcr原理和结果分析?接下来我们就一起去研究一下吧!

实时荧光定量pcr原理和结果分析

一、实验器材及试剂

1、 实验器材

• 多样品研磨珠均质仪
• 台式高速冷冻型微量离心机
• 荧光定量PCR仪
• 超净工作台
• 分光光度计
• 离心管
• TIP头

2、 主要实验试剂及耗材

RNA提取液

三氯甲烷

异丙醇

无水乙醇

HyPure TMMolecular Biology Grade Water

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit

FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)

引物

75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制

离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。

二、荧光定量PCR实验步骤

1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

3）充分研磨直至无可见组织块。

4）12000rpm离心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

6）4℃ 下12000rpm离心10min。

7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

8）-20℃ 放置15min。

9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11）4℃下12000rpm离心5min。

12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃ 孵育5min。

15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。

16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl 逆转录引物。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4）于PCR仪上65℃ 保温5min，迅速置冰上冷却。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

2× qPCR Mix12.5μl

7.5μM基因引物2.0μl

反转录产物2.5μl

ddH2O8.0μl

2）PCR扩增

预变性95℃，10min

循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s

熔解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃

4、结果处理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

K=A-B

表达倍数=2-K

,