pcr是怎么检测碱基对序列的（筛个稳转株真就这么难）

目的基因在细胞水平上的导入方式可以通过瞬转的方式进行，但想要长期在目的细胞中研究基因功能，需要建立稳转细胞系，可以降低频繁转染或者病毒包装的成本，方便实验研究。接下来，小编将对整个筛选流程进行一个简单的介绍。

一、慢病毒介导的稳转株筛选原理

筛选流程示意图

实验原理：通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并随细胞分裂稳定传递，最后用载体中所含抗性基因进行筛选。

抗性选择：常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)和杀稻瘟菌素（blasticidin)。

二、准备及预实验-MOI摸索及

抗性浓度摸索

慢病毒感染MOI预实验

根据《慢病毒感染手册》筛选出该细胞的MOI值。

Puromycin工作浓度筛选预实验

大部分细胞puromycin的工作浓度为1~10μg/ml在《慢病毒感染手册》上查阅Puromycin目的细胞中筛选的致死筛选参考用量。部分细胞的参考用量可参见附录2《常见细胞MOI及感染条件》，请在筛选时设置未感染病毒的野生型细胞对照，加入等量浓度的Puromycin。

如未在附件中找到使用的细胞，在正式实验前，先进行puromycin梯度筛选预实验（确定能在2天杀死野生型细胞的最低Puromycin浓度）。具体步骤如下：

1. 提前24h将细胞铺入24孔板，细胞量根据细胞生长状态及大小调节，在24h后，细胞密度在70%左右；

2.细胞生长24h后，加入不同终浓度的puromycin，如图所示；

Puromycin浓度分组情况

3. 再培养48h，显微镜下观察，将全部杀死细胞的最低浓度的puro组作为工作浓度。

三、稳定株筛选

慢病毒感染48-72h后（70-80%融合度），将细胞继续培养于含适当浓度Puromycin的培养液中，筛选48h后，空细胞加puro组全部死亡，我们认为感染病毒组剩下全部是阳性细胞，进行以下操作：

A. 混合克隆稳转株的构建

1. 目的细胞病毒感染

处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成 3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右，按照预实验结果，参考表1更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。参照预实验结果，选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养，一般为感染后8-16h左右。

表1.贴壁细胞接种和病毒感染时的体积

按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成 3-5×105个/mL悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中。铺板后无需培养，参照预实验确定的 MOI 加入最适病毒量感染。参照预实验结果，选择感染后最适时间点，一般为 8-16h 左右，将各孔中细胞收集到干净的 1.5 ml EP 管中，以 1300 rpm 离心 2 min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后放回培养板中继续培养。

表2.悬浮细胞接种体积

2. 感染后细胞加入抗生素筛选

1）感染 72h 后，观察细胞状态和感染效率。要求细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证 NC 组与 CON 组细胞状态相当。

2）加入合适浓度的抗生素，筛选至少 48h。如病毒载体带有荧光标记，荧光效率需要达到 100%后，降低抗生素维持浓度（相较之前的药筛浓度，浓度减至之前浓度的 1/2~1/4 或更低）继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，同时收集细胞进行下游 qPCR 检测（鉴定目的基因表达水平）。

3. 细胞扩增、冻存、复检

1）将加入抗生素维持浓度的细胞继续进行扩增。待 qPCR 检测结果合格后进行冻存，保证每株细胞至少冻存 6 支。

2）冻存2-3天后，任意复苏一支，判断复苏细胞状态。

B. 单克隆稳转株的构建

对感染并筛选后的混合克隆稳转株细胞进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养，以获得性状单一、表达稳定的细胞株：

具体步骤如下：

1）将细胞消化后接种于96孔板中，接种的细胞密度为1个/孔（可通过有限稀释的方法，也可通过流式分选）；

2）标记出具有单个细胞的孔等细胞扩增后用puro进行筛选；

3）筛选完毕后，收集细胞进行qPCR或Western Blot鉴定，选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种

另外小编也整理了一些稀释法的方案给大家作为参考：

1）倍比稀释筛选

细胞计数设定首排的浓度，例如首孔设置10* cells/孔，每孔50*μl （细胞浓度：100* cells/ml），96孔板补足最终培养体积100ul。

倍比稀释方法举例

注：标*体积均为参考，大家可以根据自己的实际情况进行调整

2）两步系列稀释筛选

两步系列稀释方法举例

稀释倍数参考：以首孔浓度选择1E4cell/孔*举例，标红区域出现1个细胞的概率更大

3）直接稀释至1个/孔：以96孔板为例，将细胞消化后接种于96孔板中，接种的细胞密度为1个/孔。

前面介绍的都是关于单个病毒的稳转株构建方法，如果是两个病毒的话，具体应该如何操作呢？下面，小编以吉凯基因CRISPR/Cas9双载体慢病毒为例进行介绍。

首先，让我们了解一下载体系统：

吉凯CRISPR/Cas9双载体慢病毒质粒系统

1. 双载系统：通过两个慢病毒分别向细胞导入 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列表达框，从而实现对目的基因的敲除。Cas9 蛋白载体带有嘌呤霉素标记，sgRNA 带有绿色荧光标记/红色荧光/新霉素抗性可选。

2. 具体实验步骤：

1）Cas9慢病毒稳转株构建

先感染Cas9慢病毒，参照《慢病毒感染手册》，选择MOI在70-80%的病毒剂量进行Cas9慢病毒稳转株的构建，经合适浓度的Puromycin抗药性筛选，得到稳定表达Cas9的混合克隆细胞株（待荧光为100%后将puromycin浓度减至之前浓度的 1/2~1/4 或更低维持）；

2）Cas9慢病毒稳转株的冻存

可以先将构建好的Cas9稳转株冻存作为工具细胞株，后续其他实验也可用该细胞株进行；

3）sgRNA慢病毒感染

a. MOI摸索预实验：可参考Cas9慢病毒MOI进行，也可以用sgRNA对照慢病毒进行预实验，摸索合适的MOI，选择MOI在70-80%的病毒剂量进行sgRNA慢病毒感染实验；

b. 筛选靶点有效性：分别使用sgRNA慢病毒对Cas9稳转株进行感染，判断靶点有效性，选取有效的sgRNA慢病毒进行后续稳转株的构建。

c. 有效Cas9-sgRNA稳转株的构建：筛选出有效靶点后，可进行多克隆、单克隆稳转株的构建（如需构建单克隆稳转株，建议筛选出有效靶点后再进行单克隆稳转株筛选，否则会导致工作量较大）。

d. 报告基因的选择及后续维持：一般第二次感染病毒的报告基因默认选择新霉素抗性，除此之外也可选择荧光标签进行筛选，需要注意的一点是，报告基因的选择的选择决定了后续稳转株的筛选方式（真核抗性筛选or流式分选）

• 如使用新霉素抗性，后续即为嘌呤霉素 新霉素抗性筛选（筛选成功后，需同时加入这两种抗性，浓度为筛选时的 1/2~1/4 或更低维持）；
• 如使用荧光蛋白标签筛选，则第二次感染之后需要使用流式分选荧光蛋白表达阳性的细胞，稳转株构建成功后需要嘌呤霉素抗性（浓度为筛选时的 1/2~1/4 或更低维持）。

与单载体系统相比，双载体系统需要两个病毒进行感染，同时可以得到Cas9慢病毒稳转株作为工具细胞株，大家可以根据自己的实验需求进行选择，把控好病毒的感染时间、调整好细胞状态，同时也要提前考虑好选择两种不同的抗性筛选方式，从而完成稳转株的筛选。

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