nature 综述癌症免疫治疗最新进展（Nature子刊肿瘤类器官）

近日，清华大学医学院生物医学工程系刘鹏研究员课题组联合北大人民医院王俊院士团队、北京航空航天大学陈晓芳课题组在学术期刊《Nature Communications》上在线发表类器官与芯片结合的研究新成果“Patient-derived organoids analyzed on a superhydrophobic microwell array for predicting drug response of lung cancer patients within a week”。

研究成果将微流控芯片与肿瘤类器官这两项前沿技术结合，显著提高了对肿瘤患者抗癌药物临床疗效预测的效率和时效。

精准治疗时代，肿瘤体外药敏预测是个体化治疗的重要研究方向。近年来肿瘤类器官技术取得重要进展，在多个癌种中均开发出预测患者对于药物抗癌疗效的体外模型。但在肺癌领域，肿瘤类器官模型的构建和应用受限于效率和时耗等问题，较其他癌种更为困难。研究团队结合了微流控芯片与肿瘤类器官技术，开展了跨领域、面向临床的联合攻关，开发出全新的集成超疏水微孔阵列芯片（InSMAR-chip），可在一周内获得肿瘤类器官药敏预测结果，极具临床转化前景。

研究团队首先改进了肿瘤样本的处理方法，采用机械处理方法从手术切除和活检的新鲜肿瘤组织中培养出大量肺癌类器官（lung cancer organoids, LCOs），证实LCOs保留了亲代肿瘤的组织学与遗传学特征，并具有无限传代扩增的潜力。同时，团队开发了InSMAR-chip，将其用于LCOs的高通量三维培养和分析。由于芯片上的微孔体积为纳升量级，大幅降低样本消耗量和培养时耗，仅在一周时间内完成药物反应的测试，并获得药敏结果。后续实验充分证明了这些药物测试结果与患者来源的异种移植物、肿瘤的基因突变和临床结果高度吻合。LCOs模型与微流控芯片的结合，为临床上预测患者特异性药物反应提供了一种有效、可靠的技术手段。

研究结果

1. 患者癌组织来源的LCOs的培养

团队采用机械方法共处理了103例手术切除的肺部肿瘤样本，其中71例腺癌(AC)、23例鳞状细胞癌(SCC)、4例小细胞肺癌(SCLC)和5例其他类型的肺癌，最终的类器官培养成功率为79%（55/71 AC，18/23 SCC，4/4 SCLC，4/5其他类型肺癌）。

图1. 从患者肿瘤中建立LCOs，用于随后长期培养以及为期一周的InSMAR-chip上药物敏感性试验流程图

2. LCOs的特征团队所建立培养的LCOs保留了原始肿瘤组织的组织学和遗传学特征，并且能在长期体外培养和传代后保持稳定，下图结果表明第0代的LCOs具有肿瘤类器官的主要特征。

图2.肺癌组织和衍生的肿瘤类器官的H&E和免疫组化染色图像。H&E染色结果显示LCOs具有3D结构，与体内肿瘤一致。来源于腺癌的LCOs维持腺泡或实体结构，甲状腺转录因子1（TTF- 1）和细胞角蛋白7（CK7）的表达模式也保留在类器官结构中。鳞状细胞癌类器官细胞LC97-O表现出低分化、高增殖、p40阳性表达和CK5/6部分表达，再现了原始肿瘤组织的特征。

图3.肺癌组织、LCOs对全基因组拷贝数变异（CNV）的热图。在原始肺癌组织中发现的DNA拷贝数增加（红色）和减少（蓝色）保存在相应的肿瘤类器官中。与原始肿瘤组织（T：组织，O：类器官）相比，所有LCOs均可见信号放大。

3. 集成超疏水微孔阵列芯片药物敏感性测试验证集成超疏水微孔阵列芯片具有通量高、体积小、节约样本和试剂并可进行实时的追踪和寻址的特征，该芯片表面由于注入了超疏水涂层，使得微孔之间具有物理隔绝，保证了每个微孔独立的液体环境，便于加样和换液的操作，此外，芯片微孔间距与1536孔板保持一致，更适配商用的成像及检测仪器。

图4.在微孔中具有液滴阵列的InSMAR-chip芯片图。由于接触角大于160°的超疏水表面的排斥作用，当多余的培养基从芯片中吸出时，可在微孔阵列中自发形成均匀的培养基液滴阵列。

图5. LCOs芯片上和芯片外培养对比。在第7天时，四个LCOs的生长速率（g）和生存力（h）的比较表明，在芯片上和芯片外培养的LCOs之间没有显着差异（n = 20，结果显示为均值 SD）。

图6.在InSMAR-chip上进行为期一周的药物敏感性试验的流程图。AB-1：药物处理前用alamaBlueTM进行细胞活力测试，AB-2：药物处理后细胞活力测试。

图7.使用PDX衍生的类器官（PDXO）与基于PDX小鼠模型的药物敏感性测试的比较过程图

4. 基于LCOs的为期一周的药物敏感性测试对肺癌靶向药物的疗效预测

在芯片上进行的LCOs对肺癌靶向药物的疗效预测，可早于NGS检测获得疗效预测结果，并与基因突变结果一致。

图8. EGFR突变型LC132O和EGFR野生型LC133-O拟合的剂量-反应曲线提示两例肿瘤对靶向药物敏感性的差异，与临床结果非常一致。

5. 为期一周的药物敏感性试验代表了肿瘤对化疗的反应异质性

图9. 肺腺癌类器官对顺铂化疗的异质性反应。拟合的剂量-反应曲线显示了AC类器官对培美曲塞 顺铂（PC）和吉西他滨 顺铂（GC）的反应。每个数据点代表3次重复的平均值。右边的热图是两个对PC敏感的类器官和另外两个对GC敏感的类器官的例子。R表示未拟合得到IC50。

图10. 左侧的药物反应曲线显示了使用LC96-O对三种化疗方案（PC，GC和紫杉醇 顺铂）进行芯片上药物反应检测结果。右边的折线图表示用于LCOs相同的化疗方案的PDX的肿瘤体积。这3种基于顺铂的化疗方案中，没有一种能有效降低类器官的存活率。对PDX小鼠给予相同的化疗药物，均未能有效抑制异种移植瘤的生长，这与基于LCOs的检测结果一致。尽管未成功确定有效药物，这些数据表明，基于LCOs的芯片药物筛选应用于为个体患者精确选择抗癌药物的可行性。

综上所述，研究团队建立了一套有效的肺癌样本处理和分析方法，成功将药敏试验缩短至一周，相比基于PDO的药敏试验长达数周甚至数月的检测时长，新方法的时效性优势突出，检测时长符合临床实践的要求。使用InSMAR-chip进行LCOs药物敏感性检测的结果，通过与PDX模型、基因突变和临床实际疗效的对比，均证实能够预测体内肿瘤对抗癌药物的反应，并具备药物筛选的潜力。相信这项芯片与类器官结合的前沿技术会为肿瘤类器官预测药物临床反应带来新的突破，研究团队将继续协同努力，期待将这项技术在未来发展出更多的应用场景，并转化于临床，打通精准医疗的最后一公里。