基因化学合成法（Nat.Chem.从基因组）

如何寻找具有生物活性的天然产物？业内小伙伴戏称要“上山下海翻垃圾”。想想也是，特殊环境中的微生物，无疑是新颖代谢产物的宝库。传统天然产物领域的研究思路，大多以发现新化合物为基础。近些年随着技术的进步，以基因组为基础的方法开始崭露头角，基因组学的进展可以帮助研究者更全面、更系统、更准确地分析天然产物的化学多样性。这其中，研究者越来越多地认识到，动物或植物相关的微生物群落中包含大量具有新骨架结构的生物活性天然产物，而我们对这一资源的开发还远远不够。对这些生物体的研究发现，多种生产者具有大量的生物合成基因簇（BGCs）以及丰富且尚不为人知的生物合成酶家族，例如：细菌反式乙酰转移酶聚酮合酶（trans-acyltransferase polyketide synthases, trans-AT PKSs）可合成各种药学上重要的聚酮化合物（如莫匹罗星、维吉尼亚霉素）。但是，大多数trans-AT PKS存在于未被充分研究的宿主相关细菌中。

Gynuella sunshinyii是一种海洋螺菌目嗜盐细菌，从海边滩涂上生长的糙叶苔草（Carex scabrifolia）的根部分离而来。这种宿主相关细菌的基因组至少包含22个天然产物BGCs（这表明它的代谢产物很可能具有丰富的化学多样性，尽管多数尚未被分离鉴定），其中6个属于trans-AT PKS类型，4个是混合trans-AT PKS-非核糖体多肽合成酶（NRPS）体系，还包括1个（随后称为jan BGC）在发现时只能手动识别。先前的工作鉴定了G. sunshinyii YC6258菌株中的化合物1-12（图1），占22个BGCs中的8个。近日，苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的Erick M. Carreira （点击查看介绍）和Jörn Piel （点击查看介绍）等研究者继续“挖掘”其基因组，在对jan BGC的研究与分析中他们发现了一种具有全新结构的聚酮生物碱Janustatins，结合质谱和二维核磁、13C化学位移的DFT计算和横向旋转框架Overhauser效应光谱数据确定了其相对构型，并实现了其两个对映体的全合成和绝对构型的确认。Janustatins具有全新的吡啶并二氢吡喃酮杂环结构，亚纳摩尔浓度水平即可展现强的细胞毒性，有很好的药用前景。相关成果发表在Nature Chemistry 上。

图1. G. sunshinyii YC6258基因组中鉴定的生物合成位点。图片来源：Nat. Chem.

为了鉴定jan BGC产物，作者试图从生物合成基因结构中预测聚酮结构。基于计算机预测程序以及人工精修，提出了如图2b所示的核心聚酮结构，先假设R=CH3，R'=H，那么预测的结构对应于分子式C21H37NO6。为了寻找具有相似质量和原子比的代谢物，作者培养G. sunshinyii（100 mL），并通过LC-HRMS分析乙酸乙酯提取物，结果显示m/z 448.2684 [M H] 处有一个候选离子峰，其分子式可能为C25H38NO6 (Δ -1.0 mmu)。然后，作者通过乙酸乙酯提取、HPLC分离出该化合物，MS指导的分馏产生0.8 mg的janustatin A（13）和两种同系物janustatin B（14, 0.4 mg）和janustatin C（15, 0.3 mg），其中化合物13的2D NMR数据揭示了三个单元I-III（图3a）。

图2. G. sunshinyii YC6258中的jan基因簇。图片来源：Nat. Chem.

为了区分13中含氮部分可能的结构异构体，作者对候选结构进行了密度泛函理论（DFT）计算，实验结果与DFT预测相一致（图3b）。另外，作者还通过3JHH和T-ROESY数据来证实13的相对构型，并表明janustatin A的绝对构型为（6S, 8R, 11S, 12R, 13S, 14R）。在NMR测量的溶剂筛选过程中，作者发现13在CD3OD中缓慢转化为新化合物13'（图3d），其质量与13相同，并且2D NMR数据证实存在γ-内酯而不是13中的δ-内酯环。随后，作者分离出另外两种janustatin同系物，janustatin B (14) 的预测分子式为C25H39NO5 (Δ -1.0 mmu)，这比13少一个氧、多两个氢。1H NMR和HSQC谱显示出额外的亚甲基信号，2D NMR数据进一步确定了14的结构（图3c），其中13上C5处的酮基被亚甲基取代。类似地，janustatin C (15) 的分子式为C25H39NO7 (Δ -0.2 mmu)，它比13多了一个形式的H2O单元，其中C13的高场位移表明15中的内酯环已开环，同时2D NMR数据证实了15的结构。综上，Janustatins的结构除了不寻常的叔丁基、多甲基化碳链外，还具有吡啶并[3,2-b]二氢-2H-吡喃-2-酮单元，后者尚未在任何天然产物中报道过。

图3. Janustatins的结构解析。图片来源：Nat. Chem.

鉴于双环单元中有大量非质子化碳，因此作者想通过全合成来确认最初的结构假设，即确认先前通过计算预测的janustatin A (13) 的绝对和相对构型。根据逆合成分析，作者将天然产物逆推至三个片段16、17和18（图4），具体合成路线如下：首先，苄氧基乙醛19和丙烯酸甲酯20经铱催化的还原性syn-Aldol反应、TBS保护、DIBAL-还原/DMP-氧化序列得到醛17。其次，Roche酯衍生的碘化物23与伪麻黄碱丙酰胺24进行Meyers-烷基化反应得到中间体25（建立片段18所需的两个立体中心），后者经Ley-Griffith氧化、Corey-Fuchs反应以及原位甲基化得到片段18（三步收率62%），接着在二环己基硼烷的作用下进行区域选择性硼氢化并通过转金属化得到有机锌试剂，该试剂能与17进行非对映选择性乙烯基化并以高anti-选择性（d.r.>5:1，收率：46%）得到烯丙醇，此时用三甲基氧鎓四氟硼酸盐进行甲基化就能得到中间体26。随后，26经选择性脱保护和氧化-烷基化-氧化序列得到中间体27，后者经苄基醚的脱保护和Dess-Martin氧化得到醛28。然而，开发合适的羟基吡啶前体仍具有挑战性，但从极性较小的 2-溴-4-氯吡啶29来构建羟基吡啶或许是一个不错的选择。具体而言，29通过LDA介导的3-位去质子化-甲酰化反应得到醛30，后者在p-TSA的存在下于回流苯中与Z-1,4-丁烯二醇进行反应得到缩醛31，接着与原位形成的氢化镍络合物（源于(DuPHOS)NiI2和LiEt3BH）进行异构化得到烯醇醚16。在锂-溴交换后，将中间体有机锂添加到醛28中能以anti:syn>5:1的非对映选择性得到中间体33，后者在二氯化汞和氧化汞的作用下进行水解并产生γ-半缩醛差向异构体34的混合物。接下来，利用氢化钠诱导的甲硅烷基迁移来获得六元环半缩醛，并使用过钌酸四丙胺盐（TPAP）将其氧化为内酯35，后者在甲酸-水混合物中进行水解便可得到janustatin A (13)，其所有数据与天然化合物相一致。另外，janustatin A (13)和ent-janustatin A (36)均被合成，手性HPLC分析表明合成13的构型与天然产物的构型相匹配。随后，作者还进行了Janustatins的生物合成路线研究（图5）。

图4. janustatin A的全合成。图片来源：Nat. Chem.

图5. Janustatins的生物合成假设。图片来源：Nat. Chem.

最后，作者探究了Janustatins的细胞毒性。在使用感染或不感染淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的MC57G鼠纤维肉瘤细胞的实验中测试抗病毒活性时，janustatin A (13) 显示出强大的细胞毒性，在两天后以45 nM的 IC50值杀死细胞。为了研究这种有效但延迟的细胞毒性作用，作者进行了更系统的实验来测试Janustatins对不同细胞系的生物活性。对于3Y1小鼠成纤维细胞和HeLa人宫颈癌细胞，13在96 h内仅需1.8 nM浓度就具有活性。另外，janustatin A 的异构体 (13') 和janustatin B (14) 对3Y1细胞也表现出相似的作用，96 h后13、13'和14的IC50值分别为0.85 nM、16.2 nM和0.27 nM。对于HeLa细胞，13和13'的IC50值分别为0.29 nM和15.1 nM，而合成的ent-janustatin A（36）对HeLa细胞的毒性要低得多，仅为天然产物的约1/3000。

图6. Janustatins的细胞毒性测试。图片来源：Nat. Chem.

总结

在本文中，作者利用基因组预测、靶向分离和结构解析相结合的方法，鉴定出植物相关海洋细菌G. sunshinyii的强效细胞毒素Janustatins，并通过全合成获得足量的聚酮化合物，从而可以研究Janustatins的代谢和细胞靶点。此外，利用工程生物合成中的机制可以提供具有一系列氨基酸衍生的吡啶和吡咯单元，从而大大拓宽聚酮化合物的生物合成范围。

Genome-based discovery and total synthesis of Janustatins, potent cytotoxins from a plant-associated bacterium

Reiko Ueoka, Philipp Sondermann, Stefan Leopold-Messer , Yizhou Liu, Rei Suo, Agneya Bhushan, Lida Vadakumchery , Ute Greczmiel, Yoko Yashiroda, Hiromi Kimura, Shinichi Nishimura , Yojiro Hoshikawa, Minoru Yoshida , Annette Oxenius, Shigeki Matsunaga, R. Thomas Williamson, Erick M. Carreira , Jörn Piel

Nat. Chem. 2022, 14, 1193-1201, DOI: 10.1038/s41557-022-01020-0

导师介绍

Erick M. Carreira

https://www.x-mol.com/university/faculty/2773

Jörn Piel

https://www.x-mol.com/university/faculty/2833