群落竞争和群落结构稳定性（微生物群落竞争代谢和合作代谢间的两极分化）

Polarization of microbial communities between competitive and cooperative metabolism

DOI：10.1038/s41559-020-01353-4

推荐理由：

1）文章阐述了共存群落中存在的两种相互作用即代谢竞争和交叉喂食，并且使用相关指标量化了这两种作用。通过分析，作者发现共存群落中，群落成员可以根据竞争和合作分为两个群体，即竞争群体和合作群体。不仅如此，作者还报道了这两种群体可能的基因组特征以及面对营养物质变化时的策略，面对外来物种时的反应。

2）文章布局，思路和逻辑相当清晰，值得学习。

3）文章中包含多种新颖的统计分析方法，如i）基于16S从NCBI的参考序列数据库中（RefSeq database）筛选参考基因组序列的思路；ii）引入启发式方法来解决高阶相互作用问题；iii）使用物种代谢相互作用分析工具（SMETANA）量化微生物之间的代谢资源重叠（MRO）和代谢作用潜力（MIP）；iv）使用antiSMASH数据库中的生物合成基因簇注释目标物种研究物种的抗性潜力。Daniel Machado

摘要

资源竞争和代谢交叉喂养是微生物群落组装的主要驱动力。然而，这两种相互冲突的力量在自然群落组成中的反映程度尚未得到系统研究。本研究中，作者使用基因组尺度的代谢模型来评估跨越数千个栖息地的大型共存群体（多达40个成员物种）中的资源竞争和代谢合作潜力。分析揭示了两种截然不同的群落类型，在竞争与合作之间的权衡中聚集在对立的两端。一端是高度合作的群体，其特征是较小的基因组和多种营养缺陷型。另一端是高度竞争的群体，具有更大的基因组和重叠的营养需求，并拥有更多与抗菌活性相关的基因。后者主要存在于土壤中，而前者存在于自由生活和与宿主相关的生境中。群落尺度的通量模拟表明，虽然竞争群落能更好地抵抗物种入侵而不是养分变化，而合作群落对物种入侵敏感，但对养分变化具有弹性。作者还通过分析额外的数据集表明，益生菌物种的定殖与受体微生物组中合作物种的存在呈正相关。总之，本研究结果强调了自然群落组装中竞争与合作代谢之间的分歧及其对群落调节的影响。

引言

段1：微生物群落的生物性质被其组成成分（composition makeup）所决定，当组成被干扰时就会阻碍微生物的功能。然而，很难预测哪些微生物组会构成稳定的群落或者一个给定的群落将如何响应生物和非生物的干扰很难预测。

段2：可用营养物质的性质是一个群落装配和它们之间营养相互作用的根本。新陈代谢竞争与合作在改变群落结构方面的角色的评估迄今为止在一定范围内依然是有限的。

段3： 在本研究中我们使用代谢模拟和基因组分析以研究在地球微生物群项目中（EMP），在不同环境中共存的数千个群落中的资源竞争和交互共生（cross-feeding）。我们探索了这样一个假设: 代谢竞争和合作 —— 从生物合成的角度来看是负相关的 —— 以一种依赖于栖息地的方式表现出一种权衡。通过广泛的栖息地覆盖和大型共生群体的加入，我们发现了竞争群体和合作群体之间的明显分界，并提出了调节这些群体的策略。

结果：

1. 在微生物群落中多物种组之间的共存是普遍流行的

作者开始构建EMP中个体微生物的代谢模型。步骤为：首先，在NCBI的参考序列数据库中（RefSeq database），通过以97%的序列相似性挑选与16S rRNA最相近的基因组序列。然后，使用这些挑出来的基因组序列构建通过CarveMe（一种方法或算法）构建基因组尺度代谢模型。这就产生了一批具有2986种物种的独特的模型。接下来，为了揭示这些物种之间相互作用的生态相关模式，我们系统地寻早了显著共存的物种群（即在不同样本中一起出现的物种群比偶然出现的频率高；图1a和方法）。虽然已经提出了几种计算微生物样品中共存物种的方法，但大多数方法仅限于物种对。相比之下，合成群落的实验强调了群落结构和动态中高阶（higher-order）相互作用的重要性。因此，复杂群落的涌现特征不能仅从成对的相互作用中推断出来。与此相一致的是，我们以前的工作表明，在三个和四个物种的群体中，共生群落可以更清楚地与随机物种组合区分开来。

我们通过引入一种新的启发式方法（方法）来解决高阶的相互作用。简而言之，该方法从识别显著共现的物种对开始，并使用基于轮盘选择的抽样方法迭代地创建更大的组合。这种启发式的方法使我们避免了组合爆炸，并发现了数千个具有40个成员的共现群落。高阶共现群在不同的样本中普遍存在（扩展数据图2a）：一个10个物种的共现群平均出现在大约1000个样本中，而一个40个物种的共现群大约出现在100个样本中。从物种组成的角度，对所得到的共现结构进行主成分分析，显示出两个主要的共现群落（扩展数据图2b）。对于2个物种群（即物种对）来说，这些群落相互之间比较接近，但对于高阶群落来说，这些群落变得越来越远，因此表明群落组合中存在着一个两方结构。

1. 共存群落在竞争和合作景观是极化的

我们之后使用了物种代谢相互作用分析工具（SMETANA，一个基于约束的群落模仿方法），在鉴定出的共生群落中，评估了资源竞争和代谢相互依赖的范围。不像其它群落模拟方法, SMETANA不假设在群落或物种水平上有任何最优性，而只是假设每个物种可以利用现有资源 (非生物资源或其他群落成员共享的资源) 生存。使用SMETANA我们计算了所有共存群落的代谢资源重叠（MRO）和代谢相互作用潜力（MIP）（图1a）。与共生群落大小相同的随机集合作为对照组，与共生群落 (每个群落大小1000个群落) 进行对比。MRO量化了群落中所有物种之间营养需求的相似性，其反映了群落中资源竞争的风险。MIP表明了群落成员之间能够被交换的代谢产物的数量以减少它们对非生物环境的依赖。在本研究中，我们使用MIP值作为合作代谢的代理。MRO和MIP在它们的理论限制内各自评估了它们的相互作用矩阵，因此不需要生境内资源可用性的实际信息。因此，某一特定群落中竞争与合作的运作程度将取决于生境。MRO和MIR环境独立的性质使它们适用于跨多重的、差异性的生境的共存群落。此外，在不同的生境中同时存在的几个物种群表明这些群落在一定程度上独立于它们的非生物环境。从使用工程氨基酸缺陷型对大肠杆菌突变体两两培养物的系统筛选，我们还评估了MIP捕获具有生物学意义的相互作用的能力。我们观察到MIP得分正相关于高的共培生长得率（补充图1）。该结果与过去类似的实验数据支持了SMETANA模拟的关联性。

SMETANA模拟结果表明了竞争与合作之间的权衡（图1b-i）。具有高合作潜力的群落拥有低的资源重叠，而低合作潜力的群落具有高的资源重叠。与随机群落相比，共生群落不仅在竞争风险和合作潜力方面表现出显著的差异，而且在竞争-合作权衡谱的相反两端也表现出明显的极化(图1b-g)。在群落规模较大时，共生类群的区别更明显，证明了高阶相互作用的生态作用。因此，共生群落分化为高度竞争(图1b-h，绿色)和高度合作(图1b-h，橙色)的群体。这种分离与根据共生群落的物种组成所确定的两个主要群体是一致的(扩展数据图2)。竞争和合作群体的极化表明，群落成员对相反的代谢策略具有适应性。

为了检查观察到的权衡模式是否由EMP数据中的任何偏差造成(如所覆盖的栖息地、实验方案或数据处理管道)，我们使用从多个来源汇编的独立的16S扩增子数据集计算了共存群落。这一分析还表明，在光谱上随机聚集的群落中，竞争与合作之间存在明显的权衡关系(扩展数据图3)。然而，在这种情况下，共存的群落都位于光谱的合作端。这可以用在这个数据集中使用的更高丰度截止来解释。值得注意的是，高丰度是区分合作社区和竞争社区的特征之一(见下文)。

1. 竞争组和合作组的成员具有不同的代谢和适应度

为了深入了解竞争共生群落和合作共生群落之间分化的生态机制，我们比较了各自成员的代谢特征。我们观察到，在合作群落中出现的物种比代表EMP数据集的所有物种平均拥有更少的代谢基因(平均543对723,Mann-Whitney U = 5.8 × 107, z =−223.3,P < 0.001)(图2a)。接下来，我们比较了组成不同类群的物种的最低营养需求估计数 (无机化合物打折扣; 见方法)。与它们的最小代谢网络一致，当与EMP数据库中的所有物种比较时，在合作群落中的物种有更高的的营养需求 (9.9 versus 6.8, Mann–Whitney U = 1.4 × 108, z = −239.0, P < 0.001) (Fig. 2b). 相反在竞争群落中的物种具有更多的代谢基因和更低的营养需求。

合作群落成员之间的资源重叠较少，尽管每个成员都需要更多的营养，这表明群落内的营养需求多样化。为了验证这一点，我们计算了每个群落内部的网络不相似性 (定义为其成员物种的代谢网络之间的平均Jaccard距离)。结果发现，合作群落的差异性高于预期 (多10%，Mann-Whitney U = 1.3 × 107, z = 91.2, P < 0.001) (图2c)，这解释了它们的资源重叠较低、交叉共生潜力较高的原因。相反地，竞争性群落的差异性低于预期 (降低20%，Mann-Whitney U = 6.9 × 106, z =−105.5,P < 0.001)，这与它们较高的资源重叠一致。我们还分析了不同群落竞争或成员之间交换的化合物的性质(扩展数据图4)。合作群落主要需要氨基酸，而竞争群落的需求分布更广，包括氨基酸、碳水化合物和嘧啶。当比较两组时，合作群落的氨基酸互投倾向是竞争群落的3倍 (Mann-Whitney U = 1.1 × 108, z = 206.5, P < 0.001)。

竞争组和合作组之间网络规模和营养需求的显著差异表明，它们的成员物种的代谢成本存在差异。因此，我们问这种差异是否反映在竞争性和合作性群落的适应性上。为了回答这个问题，我们计算了参与共存群落的物种的总丰度(相对)，并将其与具有相同物种数量的随机子集的丰度进行了比较 (图2d)。结果表明，组成合作群落的物种数量比随机分布的物种数量多 (中位数21.6% vs 0.5%， Mann-Whitney U = 3.9 × 1012, z = 1796 6.0, P < 0.001)，在每个样本中都占总生物量的很大一部分。相比之下，参与竞争群落的物种数量仅略多于随机分布的物种数量 (中位数1.2%，Mann-Whitney U = 1.2 × 1013, z = 1020.0, P < 0.001)。由于给定物种可能是多个共存群落的一部分，我们分析了单个物种的适应度 (根据其相对丰度)与每个样本中共存伴侣总数的关系(扩展数据图5)。对于竞争群落中的物种，它们的丰度似乎不受共存物种数量的影响 (Spearman 's r =−0.02,P < 0.05)，但对于合作群落中的物种，当同一样本中存在更多的合作成员时，它们的丰度更高(Spearman 's r = 0.28, P < 0.001)。因此，作为一个交叉共生的群体的成员，似乎在提高适应性方面有很大的好处。

1. 竞争群落的成员具有更高的抗菌活性潜力

对营养物质的竞争将与其他微生物相联系，更直接的竞争模式，如抗菌化合物的生产。为了验证这一点，我们用antiSMASH数据库中的生物合成基因簇注释了本研究中考虑的所有物种。与假设一致，竞争性群落物种中与lanthipeptide产生相关的基因数量高于预期(优势比1.7,P < 0.001，超几何检验和多重检验的benjami - hochberg校正)。我们也发现在所有EMP数据库中的物种中，在基因组中编码的生物合成基因簇的数量与基因组的大小与代谢基因的数量显著正相关。这支持了资源竞争与主动对抗是密切相关的观点。

1. 合作群落占有更多的差异性的生境并维持稳定的丰度

生境内营养物质的可用性的大小驱动了代谢竞争与合作的进化。这反过来又应导致竞争性和合作性群落在生境内出现差异。我们通过使用EMP本体来测试这一点，该本体描述了17种生境类型(9种自由生活生境和8种与宿主相关的生境)(见参考文献)。当计算一个给定群落的所有成员共同出现的不同生境的数量时，我们观察到竞争性群落和合作性群落之间的显著差异(图3)。竞争性群落大多出现在自由生活的环境中，超过三分之二的样本来自土壤。然而，在自由生活和与宿主相关的生境中，包括人体、室内环境和废水处理中心都存在着合作社区。有趣的是，我们注意到在一些室内环境的样本中，竞争和合作并存。这些样本来自“家庭微生物组项目”(Home Microbiome Project)，该研究在6周的时间里追踪了18名人类和4只宠物的多个身体部位以及多个室内表面的微生物组。这些样本可能代表了来自土壤、宠物和人类在日常生活活动中接触到的细菌。

合作群落栖息地的高度多样性支持了这样一种观点，即它们作为一个群体获得优势，使它们能够在不同的环境中作为很大程度上自给自足的模块移动。然而，为了维持它们的功能，并以适当的数量交换所有必需的代谢前体，这些模块需要根据其成员的相对丰度来保持一个稳定的组成。为了验证这一点，我们使用两个不同的指标，查询了家庭微生物组项目样本中合作和竞争群落的时间稳定性: 个体稳定性(每个物种的丰度随时间的变化而变化)和群体稳定性 (群落成员的相对丰度随时间的变化而变化)( 方法)。合作群落被发现比随机组装更稳定的群落 (扩展数据图6), 无论是个体稳定(1.6倍降低变异系数在每个物种的丰度,Mann-Whitney U = 0.0, z =−11.9,P < 0.001)还是组稳定(1.9倍高相似度的丰富资料,曼-惠特尼U = 36, z = 11.8, P < 0.001)。然而，竞争性群落在稳定性方面并没有表现出一致的趋势。先前关于群落稳定性的理论研究表明，纯合作群落应该是不稳定的，重建稳定需要竞争性的互作。鉴于共存物种的群落作为较大的微生物群的一部分而存在，与其他物种的竞争相互作用和/或资源限制可能在它们的稳定方面发挥作用。总之，我们在栖息地偏好方面的发现表明，合作群落是功能耦合模块，可以在不同环境中成功迁移。

1. 合作群落中分工的演化

之后，我们研究了涉及新陈代谢基因被竞争组和合作组成员失去（或获得）的情况。首先，我们利用40个通用标记基因(Methods)重建了EMP数据集中所有物种的系统发育树，然后计算了合作和竞争群落成员之间的距离。在四个主要的门中，我们观察到竞争组和合作组的成员(图4a)，这表明代谢策略的极化是一种广泛分布的现象。我们还观察到一个广泛的分布在多个分类水平(补充图。2)。此外,我们观察到参与合作群落的物种之间的系统发生分类的距离比预期的更远 (1.04倍,Mann-Whitney U = 3.1×107 z = 46.6, P < 0.001), 而参与竞争群落中的物种在系统分类上的距离更近 (1.1倍，Mann-Whitney U = 1.6 × 107, z =−82.1,P < 0.001)(图2e)。这与代谢差异性是区分合作群落和竞争群落的特征之一的观点一致 (图2c)。

为了深入了解系统发育亲缘关系和代谢依赖之间的联系，我们计算了每个群落类型中50个最经常共存的物种之间的交叉共生得分 (方法)。与预期的一样，我们观察到合作群落中物种之间的相互作用更强(图4b)。值得注意的是，在合作和竞争社区中都观察到门间的相互作用，而且似乎是一种规则而不是例外(比门内相互作用多3倍，Mann-Whitney U = 257, z = 11.6, P < 0.001)。厚壁菌门与放线菌门和变形菌门的交叉共生相互作用占优势。一致地，这些门之间的相互作用已经在实验观察到和在微生物相互作用的系统评论报告了。

我们的结果表明，氨基酸是合作群落中代谢产物交换最多的一组(扩展数据图4)。这与之前在不同群落中氨基酸交换的实验观察结果一致。我们还观察到，在合作群落成员之间，氨基酸缺陷型的频率与氨基酸生产成本相关 (扩展数据图7)。这支持了这样一种观点，即我们的结果是没有偏差的，因为不同物种之间存在营养缺陷型的差异 (在这种情况下，这与氨基酸的代谢成本没有关系)。此外，工程互补氨基酸缺陷型已被证明能够使合成微生物群落稳定组装。在E. coli47的实验室进化过程中也观察到氨基酸缺陷型的自发获取和交叉喂食。然而，关于自然界中多物种联盟中氨基酸交换的共同进化的证据仍然有限。补足缺陷型出现在群落集合之前？还是共同进化的结果?

为了解决这个问题，我们评估了合作群落成员的氨基酸型是在物种形成后获得的还是从一个祖先物种继承的。为了进行可靠的评估，我们采用了两种互补的方法:一种基于分类学 (同一属内的营养缺型的比例)，另一种基于系统发育 (沿着系统发育树重建祖先状态)。虽然大多数氨基酸缺陷型 (117个中的81个) 似乎是遗传的(扩展数据图8)，我们也观察到少数案例 (总共12个) 表明最近获得的缺陷型 (其余24个不是决定性的)。氨基酸缺陷型的遗传意味着，由于从非生物或生物环境中获得了相应的营养物质，早先缺陷型是获得 (或保留) 。最近获得的氨基酸缺陷型，以及更高丰度的合作物种(图2d)，表明可能发生了适应性基因丢失。这些最近获得的（氨基酸缺陷型基因）频率最高的主要是脯氨酸 (溶血Gemella haemolysans，人乳杆菌和内乳杆菌)和蛋氨酸 (Anaerococcus tetradius, Micrococcus luteus和Rothia dentocariosa)。因此，存在缺陷型的物种的集合和随后的基因丢失似乎都有助于自然群落的建立。

我们进一步探讨了是否营养缺陷保留或获得主要是由环境可利用性驱动还是由共存物种的氨基酸分泌物驱动。我们测量了群落中氨基酸缺陷型的比例，该比例可以被其他群落成员补偿 (补充图3)，并观察到这个比例遵循作为群落规模函数的饱和曲线(也就是说，对于一个足够大的群落，最终，所有的缺陷型都可以由其他成员来补偿)。此外，我们观察到，与竞争或随机组合的群落相比，合作群落的这条曲线更早饱和。因此，合作群落物种间氨基酸缺陷型的互补性高于偶然 (Wilcoxon单边signed-rank检验W = 433.0, P < 0.001)，这说明了分工合作。

1. 合作和竞争群落对干扰表现出相反的敏感性

接下来，我们疑惑合作和竞争群落的差异代谢特征是否导致了对非生物和生物扰动的不同反应。为了回答这个问题，我们创建了每种类型的100个群落模型 (每个群落从最经常共存的物种中随机抽取10个成员)，并模拟了它们对非生物扰动 (养分利用率的变化)和生物扰动 (外来物种(非成员) 的引入)的响应(图5a,b)。特别是，我们分析了交叉取食相互作用网络对扰动的敏感性(方法)，使用较低的敏感性值作为群落恢复力的指标。

竞争群落对非生物扰动的敏感性高于合作群落和随机聚集群落(是随机聚集群落的1.5倍，Mann-Whitney U = 3.4 × 105, z = 12.3, P < 0.001，图5c)。这是意料之中的，因为竞争群落主要是由共享资源的竞争驱动的，而不同营养物质的引入会导致生态位的扩张。此外, 当扰动发生在厌氧环境中时，差异是不显著的 (图9)。然而, 竞争群落不太可能被引入的外来物种扰动 (1.3倍小于随机聚集的社区, Mann-Whitney U = 3.8×105,z =−9.30,P < 0.001,图5 d)。与这些结果一致的是，最近的研究表明，植物和土壤来源的群落 (竞争群落普遍存在的那种生境) 的聚集主要是由碳源决定的，因此受接种液中物种多样性的影响较小。

合作社区似乎对非生物扰动并不敏感 (只有1.04倍的敏感性高于随机控制,Mann-Whitney U = 4.6×105,z = 3.48, P < 0.001,图5度), 但对引入外来物种敏感 (双重的更敏感比随机控制,Mann-Whitney U = 2.3×105,z = 20.6,P < 0.001，图5d)。响应的中值敏感性随物种引入数量的增加呈线性增加 (R2 = 0.988, P < 0.001)。这与合作群落有多种交叉取食互作的观点是一致的，这种互作可以被入侵物种“拦截”。为了验证这一点，我们在最近的一项研究中分析了物种入侵模式，在该研究中观察到宿主对益生菌定植的特异性反应，并将个体识别为允许或抵抗定植的个体。根据我们的研究结果，我们假设允许个体的微生物群落以合作物种的存在为特征，而抵抗个体的微生物群落以竞争物种的存在为特征。为了支持这一观点，我们的分析证实，允许殖民的个体在下消化道有更大的合作物种存在，无论是从每个地点的物种总数来看(Wilcoxon单边符号秩检验，W = 28.0，P < 0.01)和相对丰度(Wilcoxon单边符号秩检验，W = 28.0, P < 0.01，扩展数据图10)。值得注意的是，这种差异在早期下消化道 (末端回肠、盲肠和升结肠)更明显。因此，合作物种的存在与益生菌物种的定殖有关，这支持了我们的假设。

讨论

在这里，我们证明了微生物群落之间的一种竞争-合作权衡。虽然这很直观，但之前的研究没有报道过，可能是由于物种数量、环境数量和共现程度的限制。例如，两项早期研究考虑了大约150个物种，其中一项研究报告了共现和竞争之间的正相关关系，而不是合作，这表明生态位过滤是物种聚集的主要驱动因素。事实上，在高阶共现时极化变得更加显著(图1b-g)，所以这种模式以前没有报道就不足为奇了。

共生微生物群落分化为竞争和合作群落，这种分化在系统发生树中的广泛分布，表明了在群落装配中的两种不同生境驱动的进化路径。一方面，竞争群落保留了不同的代谢能力来利用可利用的营养物质。这些能力间接地对抗竞争对手，减少对其他物种的依赖。这些群落的成员在生产抗菌化合物方面也有更大的潜力。另一方面，合作群落具有互补的缺陷现象，在不同生境中表现出稳定的比例，符合物种间的依赖性。这一组相互依赖的优势体现在它们的相对丰度较高(图2d)。我们的系统发育分析表明，在代谢网络中，适应型基因损失。与适应性过程相一致，对于生物合成成本高的氨基酸的缺陷型更为常见(扩展数据图7)。总的来说，代谢能力、抗菌素生产潜力、生境偏好和相对丰度的差异凸显了两个共生类群的进化冲突与合作。

我们的分析表明，栖息地的类型和基因的进化损失在决定是否会建立竞争或合作的群落中起着重要的作用。竞争性物种一般被限制在自由生活的生境中，在这些生境中，资源可能更加稀少，从而使竞争更加普遍。相比之下，与宿主相关的栖息地的营养丰富似乎支持合作物种，它们表现出互补缺陷的现象，部分原因是进化基因的丢失。作为一个高度自给自足的群体，这种适应不仅提供了一种适应优势，而且可能有助于这些物种在宿主和外部环境之间迁移时的生存。合作群落普遍较高的丰度和多样化的栖息地占据突出了代谢分工的优势。这种竞争和合作的二分法在某种程度上类似于红皇后和黑皇后的假设。前者反映在竞争性物种上，因为它们倾向于保留大多数生物合成能力，并携带用于主动拮抗的基因；后者反映在合作物种的基因丢失，导致对群落成员的依赖。我们的结果提供了证据，这两种理论在自然界中作为竞争和合作之间代谢平衡的两个极端运行。

这两种群落类型具有不同的代谢组成和栖息地偏好，这意味着任何调整或重新设计这些群落的策略都需要分别进行调整。我们的在硅的结果，以及先前发表的实验数据的支持，表明竞争性和合作性的群落在非生物和生物扰动下更具可塑性。然而，我们的结果仍然是有限的，并受到偏见的影响，因为没有参考基因组组装的物种必然被排除在我们的分析之外，而且因为不同物种的模型所基于的基因注释的质量不同。这些发现在未来可能会进一步完善，以考虑宏基因组组装的基因组，提高物种和菌株水平的覆盖率，并通过解释病毒和真菌的相互作用。综上所述，我们认为，根据群落在竞争-合作环境中的位置，设计适合其的干预策略是调节复杂微生物生态系统的关键。