蛋白互坑挑战（想研究蛋白互作）

要研究蛋白之间的相互作用，我们要怎么找到目的蛋白呢，需要解决什么问题呢？如何来开展实验呢？面对这一连串的发问，千万不要惊慌，恰巧今天这里就有一篇套路文章，我们来一起看看这蛋白间的相互作用可以怎样研究。

首先，要找到要研究的蛋白，如何找？那必须是多读文献。

该篇文章介绍到登革病毒（DENV）蛋白和 GRP78蛋白在细胞内的相互作用已有报道，而 GRP78作为Hsp70的一种，和Hsp90同属于热休克蛋白家族的伴侣蛋白，因而有必要了解一下Hsp90与DENV蛋白的相互作用。

况且先前已经有很多报道证明Hsp90在大多数病毒的复制中起重要作用，且Hsp90与DENV的E 蛋白已经证明有相互作用，那么Hsp90与DENV的其他蛋白的相互作用呢？接下来就进入正题，可以进行套路实验了。

1.检测登革病毒感染的细胞中Hsp90的表达。登革病毒编码三个结构蛋白（capsid, prM, E）和7个非结构蛋白（NS1, NS2A,NS2B, NS3, NS4A, NS4B,NS5）。

由多个蛋白编码构成的登革病毒在感染细胞后，用western blot来检测细胞内Hsp90的表达水平，由图可以看出，感染的细胞中有Hsp90的表达。

2.那么接下来，为了研究Hsp90与DENV蛋白间的相互作用，免疫共沉淀(Co-IP)是合适的选择。

Co-IP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。

所以文章中通过这个经典的实验得到Hsp90和DENV E、NS2B、NS3、NS4B、NS5在细胞内都有相互作用，但是Hsp90和DENV capsid protein的相互作用却没有观察到，即便是换了一种细胞也是同样的结果。

3.蛋白与Hsp90的相互作用已经明确，后面作者可以做些什么呢？后面提到在DENV中，NS3和NS5是有相互作用的，那么Hsp90与它俩的作用是连带的呢，还是单独的呢？

于是作者将NS3和NS5分别克隆到载体上，然后感染细胞，做免疫共沉淀，看看究竟它们三者之间的关系。结果得到，NS3和NS5分别与Hsp90有相互作用，且是单独的。

4.除了免疫共沉淀，为了能够更加清楚地看到这些蛋白与我们的兴趣蛋白Hsp90在细胞中的共存，于是另一经典实验免疫荧光共定位被利用。

共定位就如字面意思上所说的，能够表明蛋白A和B都在此细胞有表达，并且在同样的细胞内位置或细胞器。

那么在实验中，挑选的几个蛋白确实能观察到与Hsp90在细胞中的共定位。比如下图。

5.除此之外，作者将Hsp90抑制住（通过格尔德霉素GA能够明显抑制Hsp90的表达），然后再观察一些蛋白的表达是否会有明显地升高或降低。结果证实蛋白NS3、NS5表达并没有明显变化，而E蛋白的表达有明显下降。

最后在讨论部分着重阐述这些蛋白本身的作用，而因为与Hsp90的相互作用，可以猜测这些蛋白的作用被Hsp90影响了——或协同，或抑制。

综上，我们看到这样的文章思路实际上是很清晰的，而且实验也是经典实用，总结起来就是:

赶紧学起来，四分的文章也不是那么难额！