ssr原理图(六步搞定SSR引物设计)


PCR实验中,引物设计占有十分重要的地位。下面我们就来介绍一下SSR引物设计的方法:


步骤


1、将由misa得到的.misa文件的内容复制至Excel表格,并其分为2、3、4、5、6碱基重复和复合重复(多态性位点较多的一般是2、3碱基重复):

ssr原理图(六步搞定SSR引物设计)(1)


其中红色部分为SSR位点位置2.将各碱基重复的表格按照重复次数从高到低排序,理论上重复次数越多多态性越高。3.在Excel表格中去除SSR位点靠前或者靠后的序列,比如序列c12900SSR位点过于靠前,c58603SSR位点过于靠后均无法设计SSR引物.4.在原始数据中查找初筛后的数据如c20128进行查找相应序列,将序列输入Primer6设计引物。

ssr原理图(六步搞定SSR引物设计)(2)



5.引物设计时因考虑到扩增片段的长度一般150-350bp,可以在SSR位点的前后200bp设计:

ssr原理图(六步搞定SSR引物设计)(3)


6.挑选分数大于80.0,扩增片段为150-350bp的高分引物,最好设计50对进行挑选,注意设计的引物不可与SSR位点区段重叠(此例子中SSR位点区段为552-581)。此例中挑选的为第五条。

ssr原理图(六步搞定SSR引物设计)(4)


要求:1 引物长度18-22 bp2 扩增产物100-250 bp3 GC含量35%-65%4 碱基重复次数不多于4,尤其是G或C的单碱基重复最好少于35 两个引物Tm值差异控制在2℃范围内



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