甘薯组织培养技术论文（甘薯植物组织培养室规划设计与操作步骤）

一、实验室要求

理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的组织培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。

实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室更加完善。

植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。

二、实验室组成

（一）基本实验室

基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，需3-4间实验用房。

1、准备室（化学实验室）

功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。

要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。

规模化生产准备室一般设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。准备试验的过程在同一空间进行，便于程序化操作与管理，试验中减少各环节间的衔接时间，从而提高工作效率。此外还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，从而减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。

设备：准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。

2、洗涤灭菌室

功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。

要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50平方米。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。

设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。

3、无菌操作室（接种室）

功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代以及一切需要进行无菌操作的技术程序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。

要求：接种室宜小不宜大，一般7～8平方米（10-20平方米）即可，其规模根据实验需要和环境控制的难易程度而定。要求封闭性好，干爽安静，清洁明亮，能较长时间保持无菌，因此不易设在容易受潮的地方；地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒；配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；为了保持清洁，无菌室应防止空气对流。接种室要求在适当位置吊装 1～2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。

一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸，并需定期灭菌处理，还可用紫外线照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。

设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。

4、培养室

功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。要求：约需10-20平方米左右，培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。

研究用实验室，通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室，也可以根据温度设置成高温和低温培养室，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。

培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约10cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高 1．7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。

培养室最重要的因子是温度，一般保持在20—27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%～80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。

设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、转床、自动控时器、紫外灯、光照培养箱或人工气候箱、生化培养箱、边台实验台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。

5、缓冲间

功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。 进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。

要求：缓冲间需3-5平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。 缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。

设备：1-2盏紫外灯、水槽、实验台、鞋帽架、柜子、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。

三、仪器设备和器皿用具

（一）常规设备

1、天平

组织培养实验室需要2-3台不同精度的天平。

感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。

感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。

2、冰箱

各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需植物材料进行低温处理，一般普通冰箱即可。

3、酸度计

用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。

4、加热器

用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。

5、其它

纯水器、分装设备

（二）灭菌设备

维持相对得无菌环境是组织培养实验室的基本要求。

1、高压灭菌锅

用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。

2、干热消毒柜

用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。

3、过滤灭菌器

用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。

4、紫外灯

方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。

（三）无菌操作设备

1、接种箱

是使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩、入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高。

2、超净工作台

其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。

（四）培养设备

培养设备是指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。

1、培养架

目前所有植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、可充分利用培养空间，以操作方便、最大限度利用培养空间为原则。一般有4-5层，层间间隔40-50cm，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。

2、培养箱

细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、湿度控制培养箱等培养。

（五）其他设备

可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备。

四、培养容器与用具

培养容器指盛有培养基并提供培养物生长空间的无菌置，培养用具指培养物接种封口所用的各种金属或塑料制品，实验室必备。

（一）培养容器

包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。玻璃容器，一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器。

（二）金属用具

1、镊子

植物组织解剖用小的尖头镊子，分株转移繁殖转接用枪型镊子，16-22cm长。

2、剪刀

不锈钢医用弯头剪，做取材和切段转移繁殖，14-22cm。

3、解剖刀

组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。

4、其他用具

接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。

（三）塑料用具

各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。

五、甘薯脱毒及脱毒种苗快繁技术

（一）甘薯脱毒

选择适合当地环境条件和市场需求的优势高产品种，取其10cm长的健壮茎段，剪去叶片，消毒灭菌，具体方法是：流水冲洗8—10min，在70％乙醇中浸泡10—20s。再用0．1％多菌灵浸泡8min，0．1％升汞水消毒lOmin，最后用无菌水冲洗5次。灭菌后对材料的处理及培养需在无菌条件下进行。在解剖镜下剥去顶芽或腋芽上较大的幼叶，切取0．3mm左右带l一2个叶原基的茎尖组织，接种到茎尖培养基上培养，即可得到脱毒幼苗。一般脱毒率可达90％ 以上。

（二）茎尖培养及脱毒鉴定

茎尖培养用MS培养基，PH值调为5.8。在温度25—28℃，光照强度l500—2000k，日光照12—14h条件下培养，20d左右茎尖组织可形成2—3mm小芽点，且基部形成黄绿色愈伤组织，此时需转入MS培养基上培养。当幼苗长刘5cm时，将茎尖幼苗进行短枝试管切段快繁，除顶芽带l 一2片展开叶外，其余切成每段带一节一叶的短技，插于MS培养基本培养并进行再繁殖(所需条件同上)。30d左右要形成具有6—8片展开叶的试管苗，合格后的脱毒苗再进行快繁。

（三）脱毒种苗快繁

脱毒种苗快繁可分为短枝切段试管快繁(方法同茎尖苗短枝试和切段快繁)和防虫网室快繁两类。

防虫网室采用60—80目的防虫网罩在棚架外而成。取洗净培养具有6—8片展开叶的试管苗，栽于小棚内灭菌的蛭石中炼苗5—10d，待形成新根后直接接移栽入网室中种植，当茎长到l5个展开叶以后，定期(1Od一次)剪秧，分成带5—8片叶的种苗可直接用于生产和繁种，秋后可收获大量原原种供应生产。将原原种在未种甘薯的地区进行栽培即可收获大量原种进行育苗获得脱毒苗

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