动植物基因组dna的提取（酵母基因组DNA的提取）

【实验目的】

（1）掌握酵母基因组DNA提取的原理。

（2）掌握酵母基因组DNA提取的方法及操作过程。

（3）熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的操作过程。

【实验原理】酵母是单细胞真核生物，细胞膜外有细胞壁，抽提酵母基因组DNA的关键是破坏细胞外的细胞壁。酵母裂解酶（Zymolyase）或溶壁酶具有酵母细胞壁酶的活性，本方法采用蜗牛酶处理去除酿酒酵母细胞壁。去壁后的酿酒酵母细胞用SDS溶液处理，使细胞破裂，并使蛋白质变性，释放基因组DNA，再利用乙酸钾溶液低温处理，使基因组DNA充分复性，溶解于水，最终通过乙醇沉淀获得基因组DNA。这一方法避免使用酚和氯仿等有机溶剂，操作更为简单、安全。

【实验材料、试剂及仪器】

1．实验材料酿酒酵母菌株CJY151（其他酿酒酵母菌株亦可）。

2．实验试剂

（1）YPD培养基：1％酵母抽提物（yeast extract），2％蛋白胨（peptone），2％葡萄糖，低温灭菌20min。

（2）20mg/mL Zymolyase（酵母裂解酶）溶液：购自日本Seikagaku公司或美国Sigma公司。（3）溶液A：1mol/L山梨糖醇，100mmol/L EDTA（pH8.0）。

（4）溶液B：250mmol/L EDTA（pH8.0），400mmol/L Tris-HCl（pH8.0），2％SDS。

（5）5mol/L KAc溶液：49.1g乙酸钾溶解于100mL去离子水中，于4℃贮存。

（6）无水乙醇。

（7）70％乙醇：70mL无水乙醇用无菌水定容至100mL。

（8）含10μg/mL RNase A的TE缓冲液：10mL TE缓冲液［10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），121℃高压灭菌20min，备用］中加入10mg/mL RNase A溶液10μL。

（9）TE缓冲液（pH7.5）：10mmol/L Tris-HCl（pH7.5），1mmol/L EDTA（pH 8.0），121℃高压灭菌20min，备用。

（10）琼脂糖凝胶电泳相关试剂。

3．实验仪器

台式高速离心机（每8人1台）恒温水浴锅（每8人1台）1．5mL无菌离心管（每人4支）移液器（每2人1套）1mL和200μL无菌吸头（每人10支）吸水纸（每4人1卷）琼脂糖凝胶电泳相关仪器

【实验步骤】

（1）接种酿酒酵母菌于5mL YPD液体培养基中，30℃振荡培养36h以上，取1.5mL菌液，10000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液。

（2）加入500μL溶液A，振荡混匀。

（3）加入3μL20mg/mL Zymolyase溶液，37℃温育1h后，5000r/min离心2min，弃上清液。（4）加入400μL TE缓冲液（pH7.5），吹打混匀后，5000r/min离心2min，弃上清液。

（5）菌体重悬于350μL TE缓冲液（pH7.5）中。

（6）加90μL溶液B，65℃水浴30min。

（7）加入80μL5mol/L KAc溶液，4℃静置2h后，4℃、12000r/min离心5min。

（8）上清液转移到1mL无水乙醇中，4℃、12000r/min离心5min，弃上清液。

（9）沉淀用0.4mL70％乙醇洗1次后，4℃、12000r/min离心5min，弃上清液。

（10）沉淀溶于40μL无菌水中，备用。

（11）如需去除产物中的RNA，可加入适量含10μg/mL RNase A的TE缓冲液，处理1h。

（12）取10μL样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

【实验注意事项】

【典型实验结果分析】1．理想实验结果（见图5.2，泳道1）DNA分子大于23kb，条带清晰，可直接用于后续的分子生物学操作。如果没有进行去除RNA的操作，那么在凝胶前端有较大量的RNA条带。由于RNA的存在不影响后续分子生物学操作，因此在酵母基因组DNA抽提过程中，该步骤可以省略。

图5.2　酿酒酵母基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果1M：DNA分子大小标准参照物；1～2：酿酒酵母基因组DNA（未去除RNA）

图5.3　酿酒酵母基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果2

M：DNA分子大小标准参照物；1～2：酿酒酵母基因组DNA，均有一定程度的降解，其中1号孔的降解程度更严重2．典型实验结果1（见图5.3，泳道2）DNA分子大小正常，条带也较清晰，但条带的亮度较弱，表明DNA量较少。解决办法：增加大肠杆菌细胞数量，重新提取。

3．典型实验结果2（见图5.3，泳道1）条带弥散模糊，严重的会出现梯状条带，表明获得的基因组DNA被降解。常见的原因有：操作过程中动作过于剧烈，导致基因组DNA断裂；用于去除RNA的RNase中混有DNase。解决办法：重新提取DNA，