dna甲基化与组蛋白甲基化（表观遗传学基础）

缘起

去年冬天，朱冰与饶毅两位大牛关于“表观遗传及其在细胞命运决定中的作用”进行的辩论，引爆了学术圈的热烈围观！

无论是出于专业研究的兴趣，还是熊熊燃烧的八卦之魂驱动，相信很多小伙伴当时都守在电脑前，过了把瘾吧？

看门道也好，听热闹也罢，表观遗传学近几年取得的一系列研究进展，确实吸引着越来越多的关注！为了帮大伙儿梳理一下表观遗传学的基本概念和研究方法，小编打算开一个系列专题，详细聊一聊这里面的弯弯绕！

话说，关于表观遗传学，小编被问得最多的问题，就是应该如何研究DNA甲基化，哪些技术适合我使用？

每次，小编都会耐心地把各种技术的优势解释一遍。说的多了，发现说来说去就是几个核心点，干脆列出来，跟大伙儿分享一下：

1：在表观遗传修饰中存在哪些甲基化修饰？

2：DNA甲基化起到的作用是什么？

3：现在研究DNA甲基化的技术手段有哪些？各有什么优势和劣势？

4：常规的分析方法及内容有哪些？

什么是甲基化修饰

首先说一下第一个问题，存在哪些甲基化修饰

现在对于甲基化修饰的研究，总的来说大致可以分为三大类：

--DNA甲基化修饰，这一类是研究最多，修饰也最为稳定的类型；

--组蛋白甲基化修饰，以及乙酰化（如果大伙儿对这块也感兴趣，小编下次可以开一个专题来单独讲了，这里就不啰嗦了）；

--RNA甲基化修饰，虽然RNA的修饰有100多种，但A碱基甲基化修饰（6mA）研究最为成熟和火爆，后续系列小编会慢慢讲。

今天我们重点聊一聊DNA的甲基化修饰。

那么，什么是DNA甲基化修饰呢？简单的讲，就是在DNA上胞嘧啶发生了一个甲基基团的修饰，有图有真相：

因此，提到DNA甲基化的时候，我们也会说5mC甲基化。别看这只是一个小小的改变，它所起到的作用却是巨大的！有些科学家甚至将DNA甲基化叫做“第五种碱基”！

DNA甲基化的作用

那么第二个问题就来了，这玩意儿有什么作用呢？

简单来说，DNA甲基化可以调控基因的表达。以高等动物为例，每个个体从一个受精卵发育成成体的过程中，DNA甲基化都是不同的，会调控不同的细胞往不同的方向分化。比如，哪些细胞群变成大脑，哪些变成心脏，都和它有着密切的关系。

另外一个方面，当我们长大了，如果某些关键基因的DNA甲基化发生了改变，那就坏掉了，很可能会引起癌症，糖尿病等多种疾病。

在人以及各种哺乳动物中，很多C和G连续的碱基上会发生DNA甲基化，而与C相邻的其他碱基则不会，这种现象与DNA甲基化修饰酶有一定的关系。

在人的基因组上，有很多CG碱基聚集的地方，我们称之为CpG岛，这个地方往往是低甲基化的，如果甲基化发生了改变，就会导致后面的基因无法表达，进而就会有一系列问题了。所以在大量的文献中，CpG岛的甲基化修饰一直是研究重点。

现在又有了CpG 海岸的概念。啥意思呢？就是科学家们发现，除了CpG岛会出问题，岛旁边的位置也很容易发生改变！

在很多研究中，大家都会关心DNA甲基化是不是导致基因表达变化了，而很多转录起始位置附近也会有CpG岛，所以我们也常常会把研究的焦点集中于转录起始位置的启动子区域（一般是转录起始位置上游2k，下游500的样子，当然不同研究中的定义略有不同）。

除了发现DNA甲基化会调控基因表达，也有发现表明，外显子和内含子的DNA甲基化异常也会导致不同的选择性剪切，这个也是一个重要的研究内容。

研究方法与技术手段

上面说了DNA甲基化的作用，接下来聊聊第三个问题：研究DNA甲基化的技术手段有哪些咧？

简单的说，可以分为两大类。

一类是IP类的，代表作就是DNA甲基化免疫共沉淀技术（MeDIP-seq），当然还有专门富集CpG的MBD技术，不过研究的不多。

另外一类就是今天要说的重点内容：重亚硫酸盐处理技术。它包括的种类五花八门，比如：

--全基因组DNA甲基化技术（WGBS）

--酶切简化基因组甲基化技术（RRBS/DRRBS）

--启动子液相捕获DNA甲基化测序技术（LHC-BS）

--基于氧化的精确DNA甲基化技术（oxBS）

DRRBS技术和LHC-BS是小编自己研发的，这种技术的优势在于，想研究哪里就捕获哪里，具体的实现我们后面详细的聊。

另外，这里要重点说一下精确DNA甲基化技术。什么是精确？比如，在动物体内，DNA甲基化是一个动态变化的过程，不仅有DNA甲基化过程，也有TET酶参与的去甲基化过程。在去甲基化的过程中，甲基基团首先会被氧化成羟基，这个羟基在后续会进一步被氧化成醛基、羧基，然后就变成无官一身轻的胞嘧啶了。

图：胞嘧啶氧化过程

重亚硫酸酸盐处理以后，醛基修饰的胞嘧啶，羧基修饰的C，还有没有甲基化的C全部都会变成胸腺嘧啶T。传统的bisulfite技术研究的是甲基化和羟甲基化，而精确DNA甲基化技术是通过氧化剂，把羟基给氧化了，这样后续处理的时候，也会变成T，而剩下的就只有甲基化胞嘧啶C了。所以通过这个技术，可以将羟甲基化单独拎出来研究。目前，国内成熟的氧化甲基化技术（oxBS）由易基因独家推出。

说完了技术手段，接下来我们讨论一下各种技术的优劣势。

先说准确性。现在研究DNA甲基化，最准确的自然还是重亚硫酸盐处理，这种手段可以精确的看到每个胞嘧啶位点上的甲基化修饰情况。对于经费充足的实验室，重亚硫酸盐处理技术中的WGBS技术是首选，此技术可以覆盖全基因组，一般要求30X，比如人的基因组差不多需要90G的数据量。考虑到测序成本，此技术更适合经费充足的实验室，或者做植物研究的实验室。

对于精度要求更高的，比如只研究精确的DNA甲基化的修饰情况，或者是想研究羟甲基化的修饰情况，oxWGBS是首选，它的成本也相对比较高。此类技术的应用限制，现阶段来说就是测序成本较高。

其他定量研究DNA甲基化的技术，都是只研究基因组上一部分区域的甲基化修饰情况，代表技术有RRBS（基于酶切），LHC-BS（基于液相捕获），以及现在临床应用比较多的850k/450k甲基化芯片。

RRBS和LHC-BS是基于测序技术，研究的CpG位点数大概都是在2M左右，也是基于测序技术研究大规模样品常用的工具之一，数据量一般8-10G。

RRBS研究的区域是全基因组上的酶切位点，如MspI酶的CCGG位点等。不过此类技术在现有读长PE150的背景下会浪费很多数据（因为有效的酶切区域片段为40-220，现有测序技术会被测通，从而导致大量数据被浪费）。

而LHC-BS的优势在于可以覆盖基因组上绝大多数的启动子区域（95%），全部的CG岛和CpGshore区域，但是对实验操作者的水平要求较高。此条件下，8G的数据量，在人的样品中目标区域60M，可得到的实际深度为50~60X，和BS技术对比吻合度也比较好，对现阶段大规模DNA甲基化样品研究而言，还是一个值得选择的工具了。

再有就是450k甲基化芯片和850k甲基化芯片，这两款芯片是基于荧光定量来鉴定DNA甲基化的，和测序的结果吻合度也较好，但问题在于检测位点数太少，且现阶段的成本也不便宜，与RRBS和LHC-BS相比成本也低不了太多。

说了这么多，大伙儿是不是有点晕？来，我们整个图，直观地展示一下这几种技术在各基因元件上的覆盖情况。

DNA甲基化的数据分析

小编是生信背景，数据分析是本人的老本行。下面我们就详细聊聊第四点，DNA甲基化数据分析的常规流程及工具。

针对DNA甲基化的数据分析，基本上是三步走（大家看到的各个公司提供的分析报告也基本如此）。

首先是质控。此步骤通常是过滤低质量的reads，一般测序结果为N占总reads数50%，或者低质量base数占总base数的50%会过滤掉。如果测序数据比较充足可以不用管这个部分的参数设置。

过滤完毕后，下一步就是比对了。这个部分是很消耗资源的。一般用的研究DNA甲基化的高通量测序软件主要有BSMAP、BS Seeker、bismark、SOCS-B、BRAT等，网上有人总结过这些软件，感兴趣的小伙伴可以自行查找一下。

小编个人比较推荐BSMAP，计算速度快，操作简单，自带的脚本也可以比较方便的计算出C位点的甲基化率（CG/CHG/CHH）。

第三步，也是比较重要的一步，就是找DMR或者DMS。常见的软件有MethMarker、metilene、eDMR等。上面这两款软件对于找DMR还是不错的，当然也可以自己写脚本来验证。

另外在高级分析方面，DNA甲基化的分析也可以结合SNP的结果。这方面的软件有BS-SNPer、bis-SNP等，各有优势，有的是基于GATK流程开发的，有的是基于SOAPSNP开发的，在速度和准确性方面各有千秋。

其他的分析如ASM，推荐amrfinder软件，这款软件现在整合到了methpipe中，感兴趣的小伙伴们都可以试试。另外对于如MeDIP类的技术，一般也是先过滤低质量reads，然后再比对，call peak。不过这里小编建议对于两组peak间最好求出组间的差异，对于后续分析还是蛮有用的。

这些流程走完了之后，后面基本上都是一些功能分析的内容了，可以根据各自不同的项目分别选用不同的工具，这里就不啰嗦了。

能读到这里的小伙伴，也是真爱了！本文只是对各个技术做了简单的总结，后面会针对每个技术展开来，做详细的介绍和讨论，大伙儿如果喜欢可以继续关注。

另外，如果有关注实验部分的，可以给小编留言，小编抓紧让实验的小伙伴过来露脸。

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